Молекулярно-динамический анализ функциональной роли аминокислотных остатков V99, F124 и S125 ДНК-диоксигеназы человека ABH2

   ДНК-диоксигеназа человека ABH2 относится к семейству AlkB-подобных негемовых диоксигеназ, которые действуют на широкий спектр субстратов и обладают сложным каталитическим механизмом с участием α-кетоглутарата и иона Fe(II) в качестве кофактора. Представители семейства AlkB катализируют прямое окисление алкильных заместителей в азотистых основаниях ДНК и РНК, обеспечивая защиту от мутагенного воздействия эндогенных и экзогенных алкилирующих агентов, а также участвуя в регуляции уровня метилирования некоторых РНК. Фермент ABH2, локализованный преимущественно в ядре клетки, проявляет специфичность к двуцепочечным ДНК-субстратам и, в отличие от большинства других AlkB-подобных ферментов человека, обладает довольно широким спектром субстратной специфичности, окисляя алкильные группы таких модифицированных азотистых оснований, как, например, N 1-метиладенозин, N 3-метилцитидин, 1,N 6-этеноаденозин и 3,N 4-этеноцитидин.

   В данной работе с целью анализа механизма, обеспечивающего субстратную специфичность фермента, и выяснения функциональной роли аминокислотных остатков в составе активного центра нами выполнено молекулярно-динамическое моделирование комплексов фермента ABH2 дикого типа и его мутантных форм, содержащих аминокислотные замены V99A, F124A или S125A, с двумя типами ДНК-субстратов, несущих метилированные основания N 1-метиладенин или N 3-метилцитозин.

   Установлено, что замена V99A приводит к увеличению подвижности белковых петель L1 и L2, участвующих в связывании ДНК-субстрата, и изменяет распределение π-π-контактов боковой цепи остатка F102 с азотистыми основаниями, расположенными рядом с поврежденным нуклеотидом. Замена F124A приводит к потере π-π-стэкинга с поврежденным основанием, что, в свою очередь, дестабилизирует архитектуру активного центра, вызывает нарушение взаимодействия с ионом железа и препятствует оптимальному каталитическому позиционированию α-кетоглутарата в активном центре. Замена S125A приводит к потере прямого взаимодействия петли L2 с 5’-фосфатной группой поврежденного нуклеотида, ослабляя связывание фермента с ДНК-субстратом. Таким образом, полученные данные позволили установить функциональную роль трех аминокислотных остатков активного центра и расширить понимание структурно-функциональных связей в процессах узнавания поврежденного нуклеотида и формирования каталитического комплекса ферментом ABH2 человека.

1. Aas P.A., Otterlei M., Falnes P., Vågbø C.B., Skorpen F., Akbari M., Sundheim O., Bjørås M., Slupphaug G., Seeberg E., Krokan H.E. Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA. Nature. 2003;421:859-863. doi: 10.1038/nature01363

2. Abraham M.J., Murtola T., Schulz R., Páll S., Smith J.C., Hess B., Lindahl E. GROMACS: high performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 2015;1-2:19-25. doi: 10.1016/j.softx.2015.06.001

3. Anandakrishnan R., Aguilar B., Onufriev A.V. H++ 3.0: automating pK prediction and the preparation of biomolecular structures for atomistic molecular modeling and simulations. Nucleic Acids Res. 2012;40:W537-W541. doi: 10.1093/nar/gks375

4. Bayly C.I., Cieplak P., Cornell W., Kollman P.A. A well-behaved electrostatic potential based method using charge restraints for deriving atomic charges: the RESP model. J Phys Chem. 1993;97:10269-10280. doi: 10.1021/j100142a004

5. Bian K., Lenz S.A.P., Tang Q., Chen F., Qi R., Jost M., Drennan C.L., Essigmann J.M., Wetmore S.D., Li D. DNA repair enzymes ALKBH2, ALKBH3, and AlkB oxidize 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine in vitro. Nucleic Acids Res. 2019;47(11):5522-5529. doi: 10.1093/nar/gkz395

6. Bussi G., Donadio D., Parrinello M. Canonical sampling through velocity rescaling. J Chem Phys. 2007;126(1):014101. doi: 10.1063/1.2408420

7. Chen B., Liu H., Sun X., Yang C.-G. Mechanistic insight into the recognition of single-stranded and double-stranded DNA substrates by ABH2 and ABH3. Mol Biosyst. 2010;6(11):2143-2149. doi: 10.1039/c005148a

8. Chen B., Gan J., Yang C. The complex structures of ALKBH2 mutants cross-linked to dsDNA reveal the conformational swing of β-hairpin. Sci China Chem. 2014;57:307-313. doi: 10.1007/s11426-013-5029-z

9. Cornell W.D., Cieplak P., Bayly C.I., Gould I.R., Merz K.M., Ferguson D.M., Spellmeyer D.C., Fox T., Caldwell J.W., Kollman P.A. A second generation force field for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules. J Am Chem Soc. 1995;117(19): 5179-5197. doi: 10.1021/ja00124a002

10. Davletgildeeva A.T., Tyugashev T.E., Zhao M., Kuznetsov N.A., Ishchenko A.A., Saparbaev M., Kuznetsova A.A. Individual contributions of amido acid residues Tyr122, Ile168, and Asp173 to the activity and substrate specificity of human DNA dioxygenase ABH2. Cells. 2023;12(14):1839. doi: 10.3390/cells12141839

11. Davletgildeeva A.T., Tyugashev T.E., Zhao M., Ishchenko A.A., Saparbaev M., Kuznetsov N.A. Role of individual amino acid residues directly involved in damage recognition in active demethylation by ABH2 dioxygenase. Int J Mol Sci. 2025;26:6912. doi: 10.3390/ijms26146912

12. Duncan T., Trewick S.C., Koivisto P., Bates P.A., Lindahl T., Sedgwick B. Reversal of DNA alkylation damage by two human dioxygenases. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(26):16660-16665. doi: 10.1073/pnas.262589799

13. Essmann U., Perera L., Berkowitz M.L., Darden T., Lee H., Pedersen L.G. A smooth particle mesh Ewald method. J Chem Phys. 1995; 103:8577-8593. doi: 10.1063/1.470117

14. Falnes P. Repair of 3-methylthymine and 1-methylguanine lesions by bacterial and human AlkB proteins. Nucleic Acids Res. 2004;32: 6260-6267. doi: 10.1093/nar/gkh964

15. Giri N.C., Sun H., Chen H., Costa M., Maroney M.J. X-ray absorption spectroscopy structural investigation of early intermediates in the mechanism of DNA repair by human ABH2. Biochemistry. 2011; 50(22):5067-5076. doi: 10.1021/bi101668x

16. Hess B., Bekker H., Berendsen H.J.C., Fraaije J.G.E.M. LINCS: a linear constraint solver for molecular simulations. J Comput Chem. 1997;18(12):1463-1472. doi: 10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:12<1463::AID-JCC4>3.0.CO;2-H

17. Jiang Y., Zhang H., Tan T. Rational design of methodology-independent metal parameters using a nonbonded dummy model. J Chem Theory Comput. 2016;12(7):3250-3260. doi: 10.1021/acs.jctc.6b00223

18. Jorgensen W.L., Chandrasekhar J., Madura J.D., Impey R.W., Klein M.L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. J Chem Phys. 1983;79(2):926-935. doi: 10.1063/1.445869

19. Joung I.S., Cheatham T.E. Determination of alkali and halide monovalent ion parameters for use in explicitly solvated biomolecular simulations. J Phys Chem B. 2008;112:9020-9041. doi: 10.1021/jp8001614

20. Kuznetsov N.A., Kanazhevskaya L.Y., Fedorova O.S. DNA demethylation in the processes of repair and epigenetic regulation performed by 2-ketoglutarate-dependent DNA dioxygenases. Int J Mol Sci. 2021;22:10540. doi: 10.3390/ijms221910540

21. Lee D.H., Jin S.G., Cai S., Chen Y., Pfeifer G.P., O’Connor T.R. Repair of methylation damage in DNA and RNA by mammalian AlkB homologues. J Biol Chem. 2005;280(47):39448-39459. doi: 10.1074/jbc.M509881200

22. Lenz S.A.P., Li D., Wetmore S.D. Insights into the direct oxidative repair of etheno lesions: MD and QM/MM study on the substrate scope of ALKBH2 and AlkB. DNA Repair (Amst). 2020;96:102944. doi: 10.1016/j.dnarep.2020.102944

23. Li P., Gao S., Wang L., Yu F., Li J., Wang C., Li J., Wong J. ABH2 couples regulation of ribosomal DNA transcription with DNA alkyla tion repair. Cell Rep. 2013;4:817-829. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.027

24. Maier J.A., Martinez C., Kasavajhala K., Wickstrom L., Hauser K.E., Simmerling C. ff14SB: improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. J Chem Theory Comput. 2015;11:3696-3713. doi: 10.1021/acs.jctc.5b00255

25. McGibbon R.T., Beauchamp K.A., Harrigan M.P., Klein C., Swails J.M., Hernández C.X., Schwantes C.R., Wang L.-P., Lane T.J., Pande V.S. MDTraj: a modern open library for the analysis of molecular dynamics trajectories. Biophys J. 2015;109:1528-1532. doi: 10.1016/j.bpj.2015.08.015

26. Monsen V.T., Sundheim O., Aas P.A., Westbye M.P., Sousa M.M.L., Slupphaug G., Krokan H.E. Divergent β-hairpins determine doublestrand versus single-strand substrate recognition of human AlkB-homologues 2 and 3. Nucleic Acids Res. 2010;38:6447-6455. doi: 10.1093/nar/gkq518

27. Müller T.A., Hausinger R.P. AlkB and its homologues. DNA repair and beyond. In: Schofield C., Hausinger R. (Eds) 2-Oxoglutarate-Dependent Oxygenases. Royal Society Chemistry. 2015;246-262. doi: 10.1039/9781782621959-00246

28. Ougland R., Rognes T., Klungland A., Larsen E. Non-homologous functions of the AlkB homologs. J Mol Cell Biol. 2015;7(6):494-504. doi: 10.1093/jmcb/mjv029

29. Parrinello M., Rahman A. Polymorphic transitions in single crystals: a new molecular dynamics method. J Appl Phys. 1981;52(12):7182-7190. doi: 10.1063/1.328693

30. Ringvoll J., Nordstrand L.M., Vagbo C.B., Talstad V., Reite K., Aas P.A., Lauritzen K.H., Liabakk N.B., Bjork A., Doughty R.W., Falnes P.O., Krokan H.E., Klungland A. Repair deficient mice reveal mABH2 as the primary oxidative demethylase for repairing 1meA and 3meC lesions in DNA. Embo J. 2006;25:2189-2198. doi: 10.1038/sj.emboj.7601109

31. Ringvoll J., Moen M.N., Nordstrand L.M., Meira L.B., Pang B., Bekkelund A., Dedon P.C., Bjelland S., Samson L.D., Falnes P.Ø., Klungland A. AlkB homologue 2 – mediated repair of ethenoadenine lesions in mammalian DNA. Cancer Res. 2008;68(11):4142-4149. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-0796

32. Šali A., Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J Mol Biol. 1993;234(3):779-815. doi: 10.1006/jmbi.1993.1626

33. Sall S.O., Berens J.T.P., Molinier J. DNA damage and DNA me thylation. In: Jasiulionis M.G. (Ed.) Epigenetics and DNA Damage. Academic Press, 2022;3-16. doi: 10.1016/B978-0-323-91081-1.00005-4

34. Sousa da Silva A.W., Vranken W.F. ACPYPE – AnteChamber PYthon Parser interfacE. BMC Res Notes. 2012;5:367. doi: 10.1186/1756-0500-5-367

35. Travers A., Muskhelishvili G. DNA structure and function. FEBS J. 2015;282(12):2279-2295. doi: 10.1111/febs.13307

36. Vanquelef E., Simon S., Marquant G., Garcia E., Klimerak G., Delepine J.C., Cieplak P., Dupradeau F.-Y. R.E.D. Server: a web service for deriving RESP and ESP charges and building force field libraries for new molecules and molecular fragments. Nucleic Acids Res. 2011;39:W511-W517. doi: 10.1093/nar/gkr288

37. Waheed S.O., Ramanan R., Chaturvedi S.S., Lehnert N., Schofield C.J., Christov C.Z., Karabencheva-Christova T.G. Role of structural dynamics in selectivity and mechanism of non-heme Fe(II) and 2-oxoglutarate-dependent oxygenases involved in DNA repair. ACS Cent Sci. 2020;6(5):795-814. doi: 10.1021/acscentsci.0c00312

38. Wang J., Wolf R.M., Caldwell J.W., Kollman P.A., Case D.A. Development and testing of a general amber force field. J Comput Chem. 2004;25:1157-1174. doi: 10.1002/jcc.20035

39. Wang J., Wang W., Kollman P.A., Case D.A. Automatic atom type and bond type perception in molecular mechanical calculations. J Mol Graph Model. 2006;25(2):247-260. doi: 10.1016/j.jmgm.2005.12.005

40. Wilson D.L., Beharry A.A., Srivastava A., O’Connor T.R., Kool E.T. Fluorescence probes for ALKBH2 allow the measurement of DNA alkylation repair and drug resistance responses. Angew Chem Int Ed Engl. 2018;57(39):12896-12900. doi: 10.1002/anie.201807593

41. Xu B., Liu D., Wang Z., Tian R., Zuo Y. Multi-substrate selectivity based on key loops and non-homologous domains: new insight into ALKBH family. Cell Mol Life Sci. 2021;78:129-141. doi: 10.1007/s00018-020-03594-9

42. Yang C.G., Yi C., Duguid E.M., Sullivan C.T., Jian X., Rice P.A., He C. Crystal structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA. Nature. 2008;452:961-965. doi: 10.1038/nature06889

43. Yang C.G., Garcia K., He C. Damage detection and base flipping in direct DNA alkylation repair. Chembiochem. 2009;10(3):417-423. doi: 10.1002/cbic.200800580

44. Yi C., He C. DNA repair by reversal of DNA damage. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5:a012575. doi: 10.1101/cshperspect.a012575

45. Yi C., Yang C.G., He C. A non-heme iron-mediated chemical demethylation in DNA and RNA. Acc Chem Res. 2009;42(4):519-529. doi: 10.1021/ar800178j

46. Yi C., Chen B., Qi B., Zhang W., Jia G., Zhang L., Li C.J., Dinner A.R., Yang C.-G., He C. Duplex interrogation by a direct DNA repair protein in search of base damage. Nat Struct Mol Biol. 2012;19: 671-676. doi: 10.1038/nsmb.2320

47. Zgarbová M., Otyepka M., Sponer J., Mládek A., Banáš P., Cheatham T.E., Jurečka P. Refinement of the Cornell et al. nucleic acids force field based on reference quantum chemical calculations of glycosidic torsion profiles. J Chem Theory Comput. 2011;7(9):2886-2902. doi: 10.1021/ct200162x

48. Zgarbová M., Šponer J., Otyepka M., Cheatham T.E., Galindo-Murillo R., Jurečka P. Refinement of the sugar-phosphate backbone torsion beta for AMBER force fields improves the description of Z- and B-DNA. J Chem Theory Comput. 2015;11(12):5723-5736. doi: 10.1021/acs.jctc.5b00716