Исследование потомства мутантов сорго, полученных с использованием генетической конструкции CRISPR/Cas9, направленной на индукцию мутаций в гене α-кафирина k1C5

Сайт-направленный мутагенез посредством генетических конструкций, несущих систему CRISPR/Cas, считается эффективной технологией, активно применяемой для решения самых разных задач генетики и селекции у многих возделываемых культур. Зерновое сорго – уникальная по своей засухоустойчивости и жаростойкости злаковая культура, служащая источником кормов и пищевого зерна в аридных регионах земного шара, приобретающая все большее значение в условиях глобального потепления климата. Одной из основных задач селекции сорго явля ется улучшение сравнительно низкой питательной ценности зерна, обусловленной в том числе устойчивостью его запасных белков – кафиринов – к протеолитическому расщеплению. Нами ранее путем использования технологии CRISPR/Cas у зернового сорго сорта Аванс были получены мутанты с улучшенной перевариваемостью кафиринов в системе in vitro. При этом в качестве мишени был выбран один из членов генного семейства, кодирующего 22 кДа α-кафирин, а именно ген k1C5. Цель данного исследования – изучение потомства полученных нами ранее растений, несущих мутации в гене k1C5, отличающихся улучшенной перевариваемостью белков зерна в системе in vitro, а имен но: анализ наследования высокой перевариваемости, проявления основных селекционно ценных признаков, а также выявление структуры нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный полипептид 22 кДа α-кафирина у ряда растений из поколения Т₀ и их потомства T₁. Обнаружено, что у четырех из шести изученных растений Т₀, а также у их потомства присутствует одна и та же мутация: замена Т→С в 23-й позиции нуклеотидной последователь ности гена k1C5, кодирующей сигнальный полипептид, которая привела к замене кодирующего триплета CTC→CCC (Leu→Pro). Эта мутация располагается за пределами выбранной мишени, в направлении 3’ от последовательности PAM. Высказывается предположение, что данная мутация могла возникнуть в результате ошибок нуклеазы Cas9, обу словленных наличием нескольких последовательностей PAM, расположенных близко друг к другу. Установлено, что потомство двух из трех изученных мутантов (семьи T₂ и Т₃), выращенное в условиях опытного поля, отличалось от исходного сорта сниженной высотой растения (на 12.4–15.5 %). Длина цветоножки, масса 1000 зерен и масса зерна с метелки не отличались от исходного сорта, за исключением потомства мутанта 2С-1.2.5b, у которого урожай зерна с метелки был снижен. В отличие от исходного сорта, у растений из поколений Т₂ и Т₃ присутствовали зерновки с модифицированным типом эндосперма (полностью мучнистым, либо с вкраплениями стекловидного эндосперма, либо с тонким стекловидным слоем). Уровень перевариваемости белков зерна в потомстве мутантов 2С-2.1.1 № 13 и 2С-1.2.5a № 14 варьировал от 77 до 84 %, значимо превышая показатель исходного сорта (63.4 ± 2.3 %, p < 0.05). Уровень перевариваемости белков из зерновок с модифицированным эндоспермом был выше, чем у зерновок с обычным стекловидным эндоспермом (84–93 %, p < 0.05). Обсуждаются причины варьирования текстуры эндоспер ма у потомства полученных мутантов и ее связь с высокой перевариваемостью кафиринов.

1. Aboubacar A., Axtell J.D., Huang C.P., Hamaker B.R. A rapid protein digestibility assay for identifying highly digestible sorghum lines. Cereal Chem. 2001;78:160-165. doi 10.1094/CCHEM.2001.78.2.160

2. Balakrishna D., Singode A., Narasimham D., Venkatesh Bhat B. Current status and future prospects of genetic transformation and gene editing in sorghum. In: Tonapi V.A., Talwar H.S., Are A.K. (Eds) Sorghum in the 21st Century: Food – Fodder – Feed – Fuel for a Rapidly Changing World. Singapore: Springer, 2020;511-535. doi 10.1007/978-981-15-8249-3_21

3. Bean S.R., Ioerger B.P., Wilson J.D., Tilley M., Rhodes D., Herald T.J. Structure and chemistry of sorghum grain. In: Rooney W. (Ed.) Achieving Sustainable Cultivation of Sorghum. Vol. 2. 2018. doi 10.19103/as.2017.0015.21

4. Belton P.S., Delgadillo I., Halford N.G., Shewry P.R. Kafirin structure and functionality. J Cereal Sci. 2006;44:272-286. doi 10.1016/j.jcs.2006.05.004

5. De Mesa-Stonestreet N.J., Alavi S., Bean S.R. Sorghum proteins: the concentration, isolation,modification, and food applications of kafirins. J Food Sci. 2010;75:90-104. doi 10.1111/j.1750-3841.2010.01623.x

6. Duressa D., Weerasoriya D., Bean S.R., Tilley M., Tesso T. Genetic basis of protein digestibility in grain sorghum. Crop Sci. 2018;58(6): 2183-2199. doi 10.2135/cropsci2018.01.0038

7. Elkonin L.A., Italianskaya J.V., Fadeeva I.Yu., Bychkova V.V., Kozhemyakin V.V. In vitro protein digestibility in grain sorghum: effect of genotype and interaction with starch digestibility. Euphytica. 2013; 193:327-337. doi 10.1007/s10681-013-0920-4

8. Elkonin L.A., Panin V.M., Kenzhegulov O.A., Sarsenova S.Kh. RNAimutants of Sorghum bicolor (L.) Moench with improved digestibility of seed storage proteins. In: Jimenez-Lopez J.C. (Ed.) Grain and

9. Seed Proteins Functionality. London: Intech Open Ltd, 2021. doi 10.5772/intechopen.96204

10. Elkonin L.A., Gerashchenkov G.A., Borisenko N.V., Sarsenova S.Kh., Panin V.M. Development of sorghum mutants with improved in vitro protein digestibility by CRISPR/Cas9 editing of kafirin genes. The Crop J. 2023;11:1411-1418. doi 10.1016/j.cj.2023.02.005

11. Ezeogu L.I., Duodu K.G., Taylor J.R.N. Effects of endosperm texture and cooking conditions on the in vitro starch digestibility of sorghum and maize flours. J Cereal Sci. 2005;42:33-44. doi 10.1016/j.jcs.2005.02.002

12. Gao C. Genome engineering for crop improvement and future agriculture. Cell. 2021;184:1621-1635. doi 10.1016/j.cell.2021.01.005

13. Gerashchenkov G.A., Elkonin L.A., Gerashchenkov K.G., Rozhnova N.A., Hiekel S., Kumlehn J., Chemeris A.V. Binary vector construction for site-directed mutagenesis of kafirin genes in sorghum.

14. Amer J Plant Sci. 2021;12:1276-1287. doi 10.4236/ajps.2021.128089

15. Guo C., Ma X., Gao F., Guo Y. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1143157. doi 10.3389/fbioe.2023.1143157

16. Impa S.M., Perumal R., Bean S.R., Sunoj V.S.J., Jagadish S.V.K. Water deficit and heat stress induced alterations in grain physicochemical characteristics and micronutrient composition in field grown grain sorghum. J Cereal Sci. 2019;86:124-131. doi 10.1016/j.jcs.2019.01.013

17. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680-685.

18. Li A., Jia S., Yobi A., Ge Z., Sato S., Zhang C., Angelovici R., Clemente T.E., Holding D.R. Editing of an alpha-kafirin gene family increases, digestibility and protein quality in sorghum. Plant Physiol. 2018;177:1425-1438. doi 10.1104/pp.18.00200

19. Li X., Liu W., Wang G., Sai-Ming Sun S., Yuan L., Wang J. Improving digestibility of sorghum proteins by CRISPR/Cas9‐based genome editing. Food Energy Secur. 2024;13:e506. doi 10.1002/fes3.506

20. Massel K., Lam Y., Hintzsche J., Lester N., Botella J.R., Godwin I.D. Endogenous U6 promoters improve CRISPR/Cas9 editing efficiencies in Sorghum bicolor and show potential for applications in other cereals. Plant Cell Rep. 2022;41:489-492. doi 10.1007/s00299-02102816-z

21. Massel K., Hintzsche J., Restall J. CRISPR-knockout of β-kafirin in sorghum does not recapitulate the grain quality of natural mutants. Planta. 2023;257:8. doi 10.1007/s00425-022-04038-3

22. Movahedi A., Aghaei-Dargiri S., Li H., Zhuge Q., Sun W. CRISPR variants for gene editing in plants: biosafety risks and future directions. Int J Mol Sci. 2023;24:16241. doi 10.3390/ijms242216241

23. Nunes A., Correia I., Barros A., Delgadillo I. Sequential in vitro pepsin digestion of uncooked and cooked sorghum and maize samples. J Agric Food Chem. 2004;52:2052-2058. doi 10.1021/jf0348830

24. Odipio J., Alicai T., Ingelbrecht I., Nusinow D.A., Bart R., Taylor N.J. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing of Phytoene desaturase in Cassava. Front Plant Sci. 2017;8:1780. doi 10.3389/fpls.2017.01780

25. Parikh A., Brant E.J., Baloglu M.C. CRISPR/Cas-mediated genome editing in sorghum – recent progress, challenges and prospects. In Vitro Cell Dev Biol – Plant. 2021;57:720-730. doi 10.1007/s11627-021-10215-y

26. Saini H., Thakur R., Gill R., Tyagi K., Goswami M. CRISPR/Cas9-gene editing approaches in plant breeding. GM Crops & Food. 2023;14: 1-17. doi 10.1080/21645698.2023.2256930

27. Sturme M.H.J., van der Berg J.P., Bouwman L.M.S., De Schrijver A., de Maagd R.A., Kleter G.A., Battaglia-de Wilde E. Occurrence and nature of off-target modifications by CRISPR-Cas genome editing in plants. ACS Agric Sci Technol. 2022;2:192-201. doi 10.1021/acsagscitech.1c00270

28. Wong A.C.S., Lam Y., Hintzsche J., Restall J., Godwin I.D. Genome editing towards sorghum improvement. In: Zhao K., Mishra R., Joshi R.K. (Eds) Genome Editing Technologies for Crop Improvement. Singapore: Springer Nature, 2022;295-321. doi 10.1007/978981-19-0600-8_14

29. Wong J.H., Lau T., Cai N., Singh J., Pedersen J.F., Vensel W.H., Hurkman W.J., Wilson J.D., Lemaux P.G., Buchanan B.B. Digestibility of protein and starch from sorghum (Sorghum bicolor) is linked to biochemical and structural features of grain endosperm. J Cereal Sci. 2009;49:73-82. doi 10.1016/j.jcs.2008.07.013

30. Wong J.H., Marx D.B., Jeff D., Wilson J.D., Buchanan B.B., Lemaux P.G., Pedersen J.F. Principal component analysis and biochemical characterization of protein and starch reveal primary targets for improving sorghum grain. Plant Science. 2010;179:598611. doi 10.1016/j.plantsci.2010.08.020

31. Zhang G., Hamaker B.R. Low α-amylase starch digestibility of cooked sorghum flours and the effect of protein. Cereal Chem. 1998;75: 710-713. doi 10.1094/CCHEM.1998.75.5.710

32. Zhu H., Li C., Gao C. Applications of CRISPR-Cas in agriculture and plant biotechnology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:661-677. doi 10.1038/s41580-020-00288-9