Сайленсинг гена фитоендесатуразы табака Бентхама Nicotiana benthamiana с помощью корневой обработки экзогенной дцРНК

РНК-интерференция – мощный инструмент для генного сайленсинга, благодаря чему используется при разработке новых подходов с большим потенциалом для защиты растений от вирусов, насекомых и других патогенов. Как правило, в таких системах геном растений подвергается модификациям с целью синтеза двуцепочечных РНК (дцРНК), необходимых для РНК-интерференции и последующего сайленсинга непосредственно в растительных клетках. Однако с учетом законодательства Российской Федерации такой подход не может использоваться на сельскохозяйственных растениях, что делает невозможным его применение при условии синтеза дцРНК самим растением. Применение экзогенно синтезированной дцРНК может стать пер спективным способом защиты растений, так как позволяет избежать создания генетически модифицированных организмов и внедрить полученную разработку в сельском хозяйстве. Также экзогенные дцРНК имеют преимущество по сравнению с химикатами (фунгицидами, инсектицидами и т. д.), используемыми для защиты растений, так как дцРНК действуют посредством своей специфической нуклеотидной последовательности, что делает описанный подход крайне избирательным к патогену и безопасным для других организмов. В совокупности вышеперечисленные факторы делают методы РНК-интерференции весьма перспективными для применения в сельском хозяйстве с целью защиты растений, поэтому встает вопрос о крупномасштабном синтезе экзогенных молекул дцРНК, специфичных к определенному патогену, и выборе оптимального способа их доставки для достижения защитного эффекта. Целью настоящей работы является сайленсинг гена фитоендесатуразы табака Бентхама (Nicotiana benthamiana) с применением экзогенно синтезированной дцРНК. Ген фитоендесатуразы – очень удобная модель в экспериментах по регуляции генной активности, так как его сайленсинг сопровождается ярким фенотипическим проявлением в виде побеления листьев. Синтез дцРНК осуществляли in vivo в клетках Escherichia сoli; в качестве способа доставки выбрана корневая обработка через полив растения – максимально простые и доступные манипуляции. Предполагается, что предложенный подход может быть масштабирован и адаптирован для защиты растений в сельском хозяйстве с помощью методов, в основе которых лежит РНК-интерференция.

1. Brigneti G., Martín-Hernández A.M., Jin H., Chen J., Baulcombe D.C., Baker B., Jones J.D.G. Virus-induced gene silencing in Solanum species. Plant J. 2004;39(2):264-272. doi 10.1111/J.1365-313X.2004.02122.x

2. Burch-Smith T.M., Schiff M., Liu Y., Dinesh-Kumar S.P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 2006; 142(1):21-27. doi 10.1104/pp.106.084624

3. Carthew R.W., Sontheimer E.J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 2009;136(4):642-655. doi 10.1016/j.cell.2009.01.035

4. Dubrovina A.S., Kiselev K.V. Exogenous RNAs for gene regulation and plant resistance. Int J Mol Sci. 2019;20(9):2282. doi 10.3390/ijms20092282

5. Gan D., Zhang J., Jiang H., Jiang T., Zhu S., Cheng B. Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection. Plant Cell Rep. 2010;29(11):1261-1268. doi 10.1007/s00299-010-0911-z

6. Jiang L., Ding L., He B., Shen J., Xu Z., Yin M., Zhang X. Systemic gene silencing in plants triggered by fluorescent nanoparticledelivered double-stranded RNA. Nanoscale. 2014;6(17):9965-9969. doi 10.1039/c4nr03481c

7. Kamthan A., Chaudhuri A., Kamthan M., Datta A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Front Plant Sci. 2015;6(APR). doi 10.3389/FPLS.2015.00208/PDF

8. Koch A., Biedenkopf D., Furch A., Weber L., Rossbach O., Abdel latef E., Linicus L., Johannsmeier J., Jelonek L., Goesmann A., Cardoza V., McMillan J., Mentzel T., Kogel K.H. An RNAi-based control of Fusarium graminearum infections through spraying of long dsRNAs involves a plant passage and is controlled by the fun gal silencing machinery. PLoS Pathog. 2016;12(10):e1005901. doi 10.1371/journal.ppat.1005901

9. Laurila M.R.L., Makeyev E.V., Bamford D.H. Bacteriophage φ6 RNA dependent RNA polymerase. Molecular details of initiating nucleic acid synthesis without primer. J Biol Chem. 2002;277(19):17117 17124. doi 10.1074/jbc.M111220200

10. Li H., Guan R., Guo H., Miao X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant Cell Environ. 2015;38(11):2277-2285. doi 10.1111/pce.12546

11. Liu Y., Schiff M., Marathe R., Dinesh-Kumar S.P. Tobacco Rar1, EDS1 and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated re sistance to tobacco mosaic virus. Plant J. 2002;30(4):415-429. doi 10.1046/J.1365-313x.2002.01297.x

12. Mitter N., Worrall E.A., Robinson K.E., Li P., Jain R.G., Taochy C., Fletcher S.J., Carroll B.J., Lu G.Q., Xu Z.P. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant vi ruses. Nat Plants. 2017;3:16207. doi 10.1038/nplants.2016.207

13. Niehl A., Soininen M., Poranen M.M., Heinlein M. Synthetic biology approach for plant protection using dsRNA. Plant Biotechnol J. 2018;16(9):1679-1687. doi 10.1111/pbi.12904

14. Nishimura A., Morita M., Nishimura Y., Sugino Y. A rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells. Nucleic Acids Res. 1990;18(20):6169. doi 10.1093/nar/18.20.6169

15. Numata K., Ohtani M., Yoshizumi T., Demura T., Kodama Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol J. 2014;12(8):1027-1034. doi 10.1111/pbi.12208

16. Ratcliff F., Martin-Hernandez A.M., Baulcombe D.C. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. Plant J. 2001;25(2):237-245. doi 10.1046/J.0960-7412.2000.00942.x

17. Tenllado F., Martínez-García B., Vargas M., Díaz-Ruíz J.R. Crude ex tracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections. BMC Biotechnol. 2003;3:3. doi 10.1186/1472-6750-3-3

18. Tiwari I.M., Jesuraj A., Kamboj R., Devanna B.N., Botella J.R., Shar ma T.R. Host Delivered RNAi, an efficient approach to increase rice resistance to sheath blight pathogen (Rhizoctonia solani). Sci Rep. 2017;7(1):1-14. doi 10.1038/S41598-017-07749

19. Wang J., Gu L., Knipple D.C. Evaluation of some potential target genes and methods for RNAi-mediated pest control of the corn earworm Helicoverpa zea. Pestic Biochem Physiol. 2018;149:67-72. doi 10.1016/j.pestbp.2018.05.012