Замалчивание гена TaAOS2 с помощью РНК-интерференции влияет на накопление фитогормонов, рост и продуктивность мягкой пшеницы

Методы обратной генетики активно используются в биологии растений для изучения функций генов, ответственных за адаптацию растений к различным стрессовым факторам окружающей среды. Данная работа посвящена получению и первичному анализу трансгенных растений мягкой пшеницы с подавленной экспрессией одного из генов алленоксидсинтазы (АОS). АОS является ключевым ферментом, участвующим в начальном этапе биосинтеза стрессовых фитогормонов, известных как жасмонаты. Для подавления экспрессии гена АОS в пшенице создан вектор для РНК-интерференционного замалчивания, содержащий инвертированную область TaAOS2 из генома яровой мягкой пшеницы сорта Chinese Spring. Путем биобаллистической генетической трансформации получен ряд трансгенных растений Chinese Spring, в которых подавление экспрессии целевого гена подтверждено с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени, а изменение уровней накопления отдельных жасмонатов выявлено методом газохромато масс-спектрометрии. В стрессовых условиях (механическое поранение листовой пластинки молодых растений) трансгенные dsRNAi линии накапливали лишь 21–44 % мРНК TaAOS2 по сравнению с нетрансгенным пораненным контролем пшеницы. Подавление экспрессии гена TaAOS2 существенно снизило накопление жасмоновой кислоты и конъюгата жасмоноил-изолейцина, в то время как уровень содержания в листьях других фитогормонов, таких как абсцизовая кислота и салициловая кислота, не изменился. Трансгенные линии пшеницы с подавленной экспрессией гена TaAOS2 демонстрировали уменьшение длины листьев на ранних стадиях развития растений; также для них была характерна тенденция к сокращению высоты растений и снижению массы зерна. При этом замалчивание не привело к изменению сроков цветения и не повлияло на фертильность растений, так как среднее количество семян в колосе не изменилось. Полученные трансгенные линии пшеницы в сочетании с линиями, сверхэкспрессирующими АОS, служат хорошим инструментом для дальнейшего детального анализа адаптивных реакций растений, контролируемых жасмонатным сигналингом.

1. An L., Wang Z., Cui Y., Yao Y., Bai Y., Liu Y., Li X., Yao X., Wu K. Bioinformatics, expression analysis, and functional verification of allene oxide synthase gene HvnAOS1 and HvnAOS2 in qingke. Open Life Sci. 2024;19(1):20220855. doi 10.1515/biol-2022-0855

2. Chehab E.W., Kim S., Savchenko T., Kliebenstein D., Dehesh K., Braam J. Intronic T-DNA insertion renders Arabidopsis opr3 a conditional jasmonic acid-producing mutant. Plant Physiol. 2011; 156(2):770-778. doi 10.1104/pp.111.174169

3. Degtyaryov E., Pigolev A., Miroshnichenko D., Frolov A., Bas net A.T., Gorbach D., Leonova T., Pushin A.S., Alekseeva V., Dol gov S., Savchenko T. 12-Oxophytodienoate reductase overexpres sion compromises tolerance to Botrytis cinerea in hexaploid and tetraploid wheat. Plants (Basel). 2023;12(10):2050. doi 10.3390/plants12102050

4. Fan Y.-H., Hou B.-Q., Su P.-S., Wu H.-Y., Wang G.-P., Kong L.-R., Ma X., Wang H.-W. Application of virus-induced gene silencing for identification of FHB resistant genes. J Integr Agric. 2019;18(10): 2183-2192. doi 10.1016/S2095-3119(18)62118-5

5. Harvey A., Moisan L., Lindup S., Lonsdale D. Wheat regenerated from scutellum callus as a source of material for transformation. Plant Cell Tissue Organ Cult. 1999;57:153-156. doi 10.1023/A:1006344615666

6. Heckmann A., Perochon A., Doohan F.M. Genome-wide analysis of salicylic acid and jasmonic acid signalling marker gene families in wheat. Plant Biol. 2024;26(5):691-704. doi 10.1111/plb.13659

7. Jiang K., Pi Y., Huang Z., Hou R., Zhang Z., Lin J., Sun X., Tang K. Molecular cloning and mRNA expression profiling of the first speci f ic jasmonate biosynthetic pathway gene allene oxide synthase from Hyoscyamus niger. Russ J Genet. 2009;45:430-439. doi 10.1134/S1022795409040073

8. Kamińska M. Role and activity of jasmonates in plants under in vitro conditions. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2021;146:425-447. doi 10.1007/s11240-021-02091-6

9. Kim S.-J., Park Y.-D., Lee J.-W. Validation of the role of Allium cepa allene oxide synthase (AcAOS) in resistance to Botrytis squamosa. Hortic Environ Biotechnol. 2025;66:951-965. doi 10.1007/s13580025-00706-x

10. Kimberlin A.N., Holtsclaw R.E., Zhang T., Mulaudzi T., Koo A.J. On the initiation of jasmonate biosynthesis in wounded leaves. Plant Physiol. 2022;189(4):1925-1942. doi 10.1093/plphys/kiac163

11. Laudert D., Pfannschmidt U., Lottspeich F., Holländer-Czytko H., Weiler E.W. Cloning, molecular and functional characterization of Arabidopsis thaliana allene oxide synthase (CYP 74), the first en zyme of the octadecanoid pathway to jasmonates. Plant Mol Biol. 1996;31:323-335. doi 10.1007/BF00021793

12. Laudert D., Weiler E.W. Allene oxide synthase: a major control point in Arabidopsis thaliana octadecanoid signalling. Plant J. 1998;15(5): 675-684. doi 10.1046/j.1365-313x.1998.00245.x

13. Liu H.-H., Wang Y.-G., Wang S.-P., Li H.-J., Xin Q.-G. Improved zinc tolerance of tobacco by transgenic expression of an allene oxide synthase gene from hexaploid wheat. Acta Physiol Plant. 2014;36(9): 2433-2440. doi 10.1007/s11738-014-1616-7

14. Miroshnichenko D., Timerbaev V., Klementyeva A., Pushin A., Sidoro va T., Litvinov D., Nazarova L., Shulga O., Divashuk M., Karlov G., Salina E., Dolgov S. CRISPR/Cas9-induced modification of the conservative promoter region of VRN-A1 alters the heading time of hexaploid bread wheat. Front Plant Sci. 2022;13:1048695. doi 10.3389/fpls.2022.1048695

15. Miroshnichenko D.N., Pigolev A.V., Pushin A.S., Alekseeva V.V., Degtyaryova V.I., Degtyaryov E.A., Pronina I.V., Frolov A., Dol gov S.V., Savchenko T.V. Genetic transformation of Triticum dicoc cum and Triticum aestivum with genes of jasmonate biosynthesis pathway affects growth and productivity characteristics. Plants ( Basel). 2024a;13(19):192781. doi 10.3390/plants13192781

16. Miroshnichenko D.N., Pigolev A.V., Tikhonov K.G., Degtyaryov E.A., Leshchenko E.F., Alekseeva V.V., Pushin A.S., Dolgov S.V., Bas net A., Gorbach D.P., Leonova T.S., Frolov A.A., Savchenko T.V. Characteristics of the stress-tolerant transgenic wheat line over expressing the AtOPR3 gene encoding the jasmonate biosynthe sis enzyme 12-oxophytodienoate reductase. Russ J Plant Physiol. 2024b;71(54):1446. doi 10.1134/S1021443724604658

17. Naor N., Gurung F.B., Ozalvo R., Bucki P., Sanadhya P., Miyara S.B. Tight regulation of allene oxide synthase (AOS) and allene oxide cyclase-3 (AOC3) promote Arabidopsis susceptibility to the root knot nematode Meloidogyne javanica. Eur J Plant Pathol. 2018; 150:149-165. doi 10.1007/s10658-017-1261-2

18. Pajerowska-Mukhtar K.M., Mukhtar M.S., Guex N., Halim V.A., Rosahl S., Somssich I.E., Gebhardt C. Natural variation of potato allene oxide synthase 2 causes differential levels of jasmonates and pathogen resistance in Arabidopsis. Planta. 2008;228(2):293- 306. doi 10.1007/s00425-008-0737-x

19. Park J.-H., Halitschke R., Kim H.B., Baldwin I.T., Feldmann K.A., Feyereisen R. A knock-out mutation in allene oxide synthase re sults in male sterility and defective wound signal transduction in Arabidopsis due to a block in jasmonic acid biosynthesis. Plant J. 2002;31(1):1-12. doi 10.1046/j.1365-313X.2002.01328.x

20. Pigolev A.V., Miroshnichenko D.N., Pushin A.S., Terentyev V.V., Boutanayev A.M., Dolgov S.V., Savchenko T.V. Overexpression of Arabidopsis OPR3 in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) alters plant development and freezing tolerance. Int J Mol Sci. 2018;19: 123989. doi 10.3390/ijms19123989

21. Pigolev A.V., Miroshnichenko D.N., Dolgov S.V., Alekseeva V.V., Pushin A.S., Degtyaryova V.I., Klementyeva A., Gorbach D., Leo nova T., Basnet A., Frolov A.A., Savchenko T.V. Endogenously produced jasmonates affect leaf growth and improve osmotic stress tolerance in emmer wheat. Biomolecules. 2023;13(12):121775. doi 10.3390/biom13121775

22. Placido D.F., Dong N., Dong C., Cruz V.M.V., Dierig D.A., Ca hoon R.E., Kang B.-G., Huynh T., Whalen M., Ponciano G., McMahan C. Downregulation of a CYP74 rubber particle protein increases natural rubber production in Parthenium argentatum. Front Plant Sci. 2019;10:760. doi 10.3389/fpls.2019.00760

23. Sun T., Chen Y., Feng A., Zou W., Wang D., Lin P., Chen Y., You C., Que Y., Su Y. The allene oxide synthase gene family in sugarcane and its involvement in disease resistance. Ind Crops Prod. 2023; 192:116136. doi 10.1016/j.indcrop.2022.116136

24. Takumi S., Shimada T. Variation in transformation frequencies among six common wheat cultivars through particle bombardment of scu tellar tissues. Genes Genet Syst. 1997;72(2):63-69. doi 10.1266/ggs.72.63

25. Zeng J., Zhang T., Huangfu J., Li R., Lou Y. Both allene oxide syn thases genes are involved in the biosynthesis of herbivore-induced jasmonic acid and herbivore resistance in rice. Plants (Basel). 2021; 10(3):30442. doi 10.3390/plants10030442