Концепция природной реконструкции генома. Часть 4. Интеграция фрагментов экстраклеточной двуцепочечной ДНК в геном гемопоэтических стволовых клеток и формирование экстрахромосомальных интермедиатов

Для оценки возможности интеграции в реципиентный геном гемопоэтических стволовых клеток экстраклеточных фрагментов двуцепочечной ДНК был сконструирован сложно составленный субстрат, состоящий из целого М13F-AluI-M13R фрагмента и двух его производных, появляющихся после гидролиза рестриктазами EcoRI и HindIII: M13F-AluI-EcoRI и М13R-AluI-HindIII. В субстрате была представлена последовательность полилинкера плазмиды pBlueScript+, отсутствующая в геноме человека, которая обрамляла клонированный по сайту EcoRV AluI фрагмент человека. Клетки костного мозга человека были обработаны ДНК сконструированного сложно составленного субстрата, и с учетом времени репарации пангеномных одноцепочечных разрывов из клеток выросших колоний получены препараты метафазных пластинок. Проведенная FISH выявила специфические сигналы свечения. Одновременно ДНК, выделенная из колоний, полученных из клеток костного мозга, обработанных сложно составленным субстратом, была секвенирована. Проведено два раунда секвенирования: полногеномное и селективное после таргетной гибридизации на металлических бусах. Полученные результаты свидетельствуют, что гомологичный обмен между экстрахромосомальной и хромосомной ДНК возможен. Также возможна интеграция в геном по механизму однонитевого отжига, с участием микрогомологий. Обнаружены интермедиаты с одним концом фрагмента, интегрированным в геном по участку микрогомологии, и другим концом фрагмента, свободно свисающим в межхромосомное пространство. Проведена прямая оценка возможности интеграции TAMRA-меченых фрагментов двуцепочечной ДНК человека и E. coli в реципиентный геном на модели клеток костного мозга человека. Обнаружено, что специфические сигналы гомологичной ДНК распределены по телу хромосом (модель клеток костного мозга человека). Сигналы негомологичной ДНК E. Coli преимущественно сконцентрированы в центромерных районах хромосом. Соотношение количества полученных ридов с элементами интеграции и сигналов FISH предполагало существование прочного взаимодействия экстраклеточных фрагментов и ДНК хромосом. В экспериментах показано, что линейная плазмидная ДНК после интернализации в гемопоэтические стволовые клетки формирует кольцо мономера. Интернализованная во внутриклеточное пространство экстраклеточная плазмидная ДНК выделяется совместно с ДНК хромосом после жестких процедур очистки и фракционирования. Этот факт предполагает существование прочного кольцевого ассоциата ДНК плазмиды и ДНК хромосом, сформированного без участия белкового каркаса в форме закольцованной хромосомной нити.

1. Cromie G.A., Connelly J.C., Leach D.R.F. Recombination at doublestrand breaks and DNA ends: conserved mechanisms from phage to humans. Mol Cell. 2001;8(6):1163-1174. doi 10.1016/S1097-2765(01)00419-1

2. Dolgova E.V., Nikolin V.P., Popova N.A., Proskurina A.S., Orishenko K.E., Alyamkina E.A., Efremov Y.R., … Taranov O.S., Rogachev V.A., Sidorov S.V., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Internalization of exogenous DNA into internal compartments of murine bone marrow cells. Russ J Genet Appl Res. 2012;2(6):440-452. doi 10.1134/S2079059712060056

3. Dolgova E.V., Efremov Y.R., Orishchenko K.E., Andrushkevich O.M., Alyamkina E.A., Proskurina A.S., Bayborodin S.I., … Omigov V.V., Minkevich A.M., Rogachev V.A., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Delivery and processing of exogenous double-stranded DNA in mouse CD34+ hematopoietic progenitor cells and their cell cycle changes upon combined treatment with cyclophosphamide and doublestranded DNA. Gene. 2013;528(2):74-83. doi 10.1016/j.gene.2013.06.058

4. Farzaneh F., Zalin R., Brill D., Shall S. DNA strand breaks and ADP-ribosyl transferase activation during cell differentiation. Nature. 1982; 300(5890):362-366. doi 10.1038/300362A0

5. Glover D.M. (Ed.) DNA Cloning. A Practical Approach. IRL Press, 1988

6. Hagan C.R., Sheffield R.F., Rudin C.M. Human Alu element retrotransposition induced by genotoxic stress. Nat Genet. 2003;35(3): 219-220. doi 10.1038/ng1259

7. Hastings P.J., McGill C., Shafer B., Strathern J.N. Ends-in vs. endsout recombination in yeast. Genetics. 1993;135(4):973-980. doi 10.1093/genetics/135.4.973

8. Hastings P.J., Ira G., Lupski J.R. A microhomology-mediated breakinduced replication model for the origin of human copy number variation. PLoS Genet. 2009;5(1):e1000327. doi 10.1371/journal.pgen.1000327

9. Holmgren L., Szeles A., Rajnavölgyi E., Folkman J., Klein G., Ernberg I., Falk K.I. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 1999;93(11):3956-3963. doi 10.1182/blood.V93.11.3956

10. Jacobson G.K., Pinon R., Esposito R.E., Esposito M.S. Single-strand scissions of chromosomal DNA during commitment to recombination at meiosis. Proc Natl Acad Sci USA. 1975;72(5):1887-1891. doi 10.1073/pnas.72.5.1887

11. Johnstone A.P., Williams G.T. Role of DNA breaks and ADP-ribosyl transferase activity in eukaryotic differentiation demonstrated in human lymphocytes. Nature. 1982;300(5890):368-370. doi 10.1038/300368A0

12. Kucherlapati R.S., Eves E.M., Song K.Y., Morse B.S., Smithies O. Homologous recombination between plasmids in mammalian cells can be enhanced by treatment of input DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1984;81(10):3153-3157. doi 10.1073/pnas.81.10.3153

13. Kumagai A., Dunphy W.G. Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts. Mol Cell. 2000;6(4):839-849. doi 10.1016/S1097-2765(05)00092-4

14. Leung W., Malkova A., Haber J.E. Gene targeting by linear duplex DNA frequently occurs by assimilation of a single strand that is subject to preferential mismatch correction. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94(13):6851-6856. doi 10.1073/pnas.94.13.6851

15. Li J., Read L.R., Baker M.D. The mechanism of mammalian gene replacement is consistent with the formation of long regions of heteroduplex DNA associated with two crossing-over events. Mol Cell Biol. 2001;21(2):501-510. doi 10.1128/mcb.21.2.501-510.2001

16. Likhacheva A.S., Rogachev V.A., Nikolin V.P., Popova N.A., Shilov A.G., SebelevaT.E., Strunkin D.N., Chernykh E.R., Gel’fgat E.L., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Involvement of exogenous DNA in the molecular processes in somatic cell. Informatsionnyy Vestnik VOGiS = Herald Vavilov Soc Genet Breed Sci. 2008;12(3):426-447 (in Russian)

17. Lin J., Krishnaraj R., Kemp R.G. Exogenous ATP enhances calcium influx in intact thymocytes. J Immunol. 1985;135(5):3403-3410

18. Lin Y., Waldman A.S. Capture of DNA sequences at double-strand breaks in mammalian chromosomes. Genetics. 2001;158(4):1665-1674. doi 10.1093/genetics/158.4.1665

19. MacDougall C.A., Byun T.S., Van C., Yee M.C., Cimprich K.A. The structural determinants of checkpoint activation. Genes Dev. 2007; 21(8):898-903. doi 10.1101/gad.1522607

20. Maizels N., Davis L. Initiation of homologous recombination at DNA nicks. Nucleic Acids Res. 2018;46(14):6962-6973. doi 10.1093/nar/gky588

21. Maniatis T., Fritch E., Sambrook D. Methods of Genetic Engineering. Molecular Cloning. Moscow: Mir Publ., 1984 (in Russian)

22. Maricic T., Whitten M., Pääbo S. Multiplexed DNA sequence capture of mitochondrial genomes using PCR products. PLoS One. 2010;5(11):e14004. doi 10.1371/journal.pone.0014004

23. McVey M., Lee S.E. MMEJ repair of double-strand breaks (director’s cut): deleted sequences and alternative endings. Trends Genet. 2008; 24(11):529-538. doi 10.1016/j.tig.2008.08.007

24. Møller H.D., Mohiyuddin M., Prada-Luengo I., Sailani M.R., Halling J.F., Plomgaard P., Maretty L., Hansen A.J., Snyder M.P., Pilegaard H., Lam H.Y.K., Regenberg B. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue. Nat Commun. 2018;9(1):1069. doi 10.1038/S41467-018-03369-8

25. Murnane J.P., Yezzi M.J., Young B.R. Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells. Nucleic Acids Res. 1990;18(9):2733-2738. doi 10.1093/nar/18.9.2733

26. Pecorino L.T., Verhaak R.G.W., Henssen A., Mischel P.S. Extrachromosomal DNA (ecDNA): an origin of tumor heterogeneity, genomic remodeling, and drug resistance. Biochem Soc Trans. 2022;50(6): 1911-1920. doi 10.1042/BST20221045

27. Perucho M., Hanahan D., Wigler M. Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells. Cell. 1980;22(1):309-317. doi 10.1016/0092-8674(80)90178-6

28. Perucho M., Wigler M. Linkage and expression of foreign DNA in cultured animal cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1981; 45(Pt.2):829-838. doi 10.1101/sqb.1981.045.01.101

29. Petrova D.D., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Ritter G.S., Ruzanova V.S., Efremov Y.R., Potter E.A., Kirikovich S.S., Levites E.V., Taranov O.S., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Bogachev S.S. The new general biological property of stem-like tumor cells (Part II: surface molecules, which belongs to distinctive groups with particular functions, form a unique pattern characteristic of a certain type of tumor stem-like cells). Int J Mol Sci. 2022; 23(24):15800. doi 10.3390/ijms232415800

30. Pierandrei S., Luchetti A., Sanchez M., Novelli G., Sangiuolo F., Lucarelli M. The gene targeting approach of small fragment homologous replacement (SFHR) alters the expression patterns of DNA repair and cell cycle control genes. Mol Ther Nucleic Acids. 2016; 5(4):e304. doi 10.1038/mtna.2016.2

31. Potter E.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Efremov Y.R., Minkevich A.M., Rozanov A.S., Peltek S.E., … Baiborodin S.I., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Bogachev S.S. Gene expression profiling of tumor-initiating stem cells from mouse Krebs-2 carcinoma using a novel marker of poorly differentiated cells. Oncotarget. 2017;8(6):9425-9441. doi 10.18632/oncotarget.14116

32. Potter E.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Ruzanova V.S., Efremov Y.R., Kirikovich S.S., Oshikhmina S.G., … Grivtsova L.U., Kolchanov N.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S. Stimulation of mouse hematopoietic stem cells by angiogenin and DNA preparations. Braz J Med Biol Res. 2024;57:e13072. doi 10.1590/1414-431X2024e13072

33. Ritter G.S., Dolgova E.V., Petrova D.D., Efremov Y.R., Proskurina A.S., Potter E.A., Ruzanova V.S., Kirikovich S.S., Levites E.V., Taranov O.S., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Bogachev S.S. The new general biological property of stem-like tumor cells. Part I. Peculiarities of the process of the double-stranded DNA fragments internalization into stem-like tumor cells. Front Genet. 2022;13:954395. doi 10.3389/fgene.2022.954395

34. Rogachev V.A., Likhacheva A., Vratskikh O., Mechetina L.V., Sebeleva T.E., Bogachev S.S., Yakubov L.A., Shurdov M.A. Qualitative and quantitative characteristics of the extracellular DNA delivered to the nucleus of a living cell. Cancer Cell Int. 2006;6:23. doi 10.1186/1475-2867-6-23

35. Ruzanova V., Proskurina A., Efremov Y., Kirikovich S., Ritter G., Levites E., Dolgova E., Potter E., Babaeva O., Sidorov S., Taranov O., Ostanin A., Chernykh E., Bogachev S. Chronometric administration of cyclophosphamide and a double-stranded DNA-mix at interstrand crosslinks repair timing, called “Karanahan” therapy, is highly efficient in a weakly immunogenic Lewis carcinoma model. Pathol Oncol Res. 2022;28:1610180. doi 10.3389/pore.2022.1610180

36. Ruzanova V.S., Oshikhmina S.G., Proskurina A.S., Ritter G.S., Kirikovich S.S., Levites E.V., Efremov Y.R., Karamysheva T.V., Meschaninova M.I., Mamaev A.L., Taranov O.S., Bogachev A.S., Sidorov S.V., Nikonov S.D., Leplina O.Y., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Dolgova E.V., Bogachev S.S. A concept of natural genome reconstruction. Part 2. Effect of extracellular double-stranded DNA fragments on hematopoietic stem cells. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov J Genet Breed. 2024;28(8):993-1007. doi 10.18699/vjgb-24-106

37. Smith A.J.H., Berg P. Homologous recombination between defective neo genes in mouse 3T6 cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1984;49:171-181. doi 10.1101/sqb.1984.049.01.020

38. Smithies O., Gregg R.G., Boggs S.S., Koralewski M.A., Kucherlapati R.S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 1985; 317(6034):230-234. doi 10.1038/317230A0

39. Spriggs A.I., Boddington M.M., Clarke C.M. Chromosomes of human cancer cells. Br Med J. 1962;2(5317):1431-1435. doi 10.1136/bmj.2.5317.1431

40. Thomas K.R., Folger K.R., Capecchi M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell. 1986;44(3): 419-428. doi 10.1016/0092-8674(86)90463-0

41. Vriend L.E.M., Krawczyk P.M. Nick-initiated homologous recombination: protecting the genome, one strand at a time. DNA Repair. 2017; 50:1-13. doi 10.1016/j.dnarep.2016.12.005

42. Wu S., Turner K.M., Nguyen N., Raviram R., Erb M., Santini J., Luebeck J., … Furnari F.B., Chang H.Y., Ren B., Bafna V., Mischel P.S. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575(7784):699-703. doi 10.1038/S41586-019-1763-5

43. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M., Ryte A.S., Yurchenko L.V., Vlassov V.V. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? Proc Natl Acad Sci USA. 1989;86(17):6454-6458. doi 10.1073/pnas.86.17.6454

44. Yoo H.Y., Shevchenko A., Shevchenko A., Dunphy W.G. Mcm2 is a direct substrate of ATM and ATR during DNA damage and DNA replication checkpoint responses. J Biol Chem. 2004;279(51):53353-53364. doi 10.1074/jbc.M408026200

45. Yoo H.Y., Jeong S.Y., Dunphy W.G. Site-specific phosphorylation of a checkpoint mediator protein controls its responses to different DNA structures. Genes Dev. 2006;20(7):772-783. doi 10.1101/GAD.1398806

46. Zhu Y., Gujar A.D., Wong C.H., Tjong H., Ngan C.Y., Gong L., Chen Y.A., … Yi E., deCarvalho A.C., Ruan Y., Verhaak R.G.W., Wei C.L. Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription. Cancer Cell. 2021;39(5):694-707.e7. doi 10.1016/j.ccell.2021.03.006

47. Zou L. Single- and double-stranded DNA: building a trigger of ATRmediated DNA damage response. Genes Dev. 2007;21(8):879-885. doi 10.1101/gad.1550307