Роль типа экспланта и применения селективного агента в первичной эффективности трансформации Lens culinaris Medik.

Lens culinaris Medik. (чечевица) – важная сельскохозяйственная культура из семейства бобовых, но модификация ее генома редко используется для создания новых сортов. Вероятно, это связано с низкой эффективностью существующих протоколов трансформации. Как правило, разработка универсальных, независимых от генотипа протоколов получения трансгенных растений зависит, среди прочего, от возможности образования существенного количества трансгенных клеток in vitro. В настоящем исследовании мы предприняли попытку адаптировать разработанный ранее для другого бобового протокол агробактериальной трансформации для получения трансгенной каллусной ткани у L. culinaris. Чтобы оценить эффективность трансформации, мы выбрали две независимые репортерные системы: бета-глюкуронидазу и зеленый флуоресцентный белок. С помощью этих систем мы нашли оптимальный тип экспланта для создания каллусной ткани чечевицы, экспрессирующей рекомбинантную ДНК. Мы также оценили влияние гигромицина, одного из распространенных селективных агентов, на количество трансгенной ткани в развивающихся трансформированных эксплантах L. culinaris. Согласно нашим результатам, протокол трансформации, который обычно применяется для эксплантов листьев Medicago truncatula Gaertn., может быть использован и для получения трансгенных каллусов из верхушек побегов L. culinaris. Экспланты из апексов побегов продемонстрировали более высокую первичную эффективность трансформации по сравнению с эксплантами из корней, стеблей и листьев. Кроме того, экспланты разных типов, культивируемые на среде без гигромицина, образовывали значительно меньше каллусов, экспрессирующих репортерные гены, по сравнению с эксплантами, выращиваемыми на среде с гигромицином. Это подтверждает возможность использования гигромицина в качестве эффективного селективного агента для чечевицы. В ходе нашего анализа мы также обнаружили GUS-подобное окрашивание в каллусах, не содержащих плазмид для экспрессии гена GUS, что можно объяснить так называемой внутренней GUS-подобной активностью, которая была описана в предыдущих исследованиях. Эти данные могут быть полезны для дальнейшей разработки эффективных и универсальных протоколов трансформации и редактирования генома L. culinaris.

1. Abdollahi M.R., Memari H.R., van Wijnen A.J. Factor affecting the endogenous β-glucuronidase activity in rapeseed haploid cells: how to avoid interference with the GUS transgene in transformation studies. Gene. 2011;487(1):96-102. doi 10.1016/j.gene.2011.07.007

2. Bakulin S.D., Monakhos S.G., Bruskin S.A. Morphogenetic factors as a tool for enhancing plant regeneration capacity during in vitro transformation. Int J Mol Sci. 2025;26(17):8583. doi 10.3390/ijms26178583

3. Cao Z., Socquet-Juglard D., Daba K., Vandenberg A., Bett K.E. Understanding genome structure facilitates the use of wild lentil germplasm for breeding: a case study with shattering loci. Plant Genome. 2024;17(2):e20455. doi 10.1002/tpg2.20455

4. Celikkol Akcay U., Mahmoudian M., Kamci H., Yucel M., Oktem H.A. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of a recalcitrant grain legume, lentil (Lens culinaris Medik). Plant Cell Rep. 2009;28(3):407-417. doi 10.1007/s00299-008-0652-4

5. Chopra R., Aparna, Saini R. Use of sonication and vacuum infiltration for Agrobacterium-mediated transformation of an Indian lentil (Lens culinaris Medik.) cultivar. Sci Hortic. 2012;143:127-134. doi 10.1016/j.scienta.2012.06.019

6. Cosson V., Durand P., d’Erfurth I., Kondorosi A., Ratet P. Medicago truncatula transformation using leaf explants. Methods Mol Biol. 2006;343:115-127. doi 10.1385/1-59745-130-4:115

7. Curtis M.D., Grossniklaus U. A gateway cloning vector set for highthroughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol. 2003;133(2):462-469. doi 10.1104/pp.103.027979

8. Das S.K., Shethi K.J., Hoque M.I., Sarker R.H. Agrobacterium-mediated genetic transformation in lentil (Lens culinaris Medik.) followed by in vitro flowering and seed formation. Plant Tissue Cult Biotechnol. 2012;22(1):13-26. doi 10.3329/ptcb.v22i1.11243

9. Das S.K., Shethi K.J., Hoque M.I., Sarker R.H. Agrobacterium-mediated genetic transformation of lentil (Lens culinaris Medik.) with chitinase gene followed by in vitro flower and pod formation. Plant Tissue Cult Biotechnol. 2019;29(1):99-109. doi 10.3329/ptcb.v29i1.41982

10. Erskine W., Muehlbauer F., Sarker A., Sharma B. (Eds) The Lentil: Botany, Production and Uses. Wallingford: CABI, 2009

11. Fåhraeus G. The infection of clover root hairs by nodule bacteria studied by a simple glass slide technique. J Gen Microbiol. 1957; 16(2):374-381. doi 10.1099/00221287-16-2-374

12. Garcia Ruiz M.T., Knapp A.N., Garcia-Ruiz H. Profile of genetically modified plants authorized in Mexico. GM Crops Food. 2018;9(3): 152-168. doi 10.1080/21645698.2018.1507601

13. Gulati A., Schryer P., McHughen A. Production of fertile transgenic lentil (Lens culinaris Medik) plants using particle bombardment. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 2002;38(4):316-324. doi 10.1079/IVP2002303

14. Hoffmann B., Trinh T.H., Leung J., Kondorosi A., Kondorosi E. A new Medicago truncatula line with superior in vitro regeneration, transformation, and symbiotic properties isolated through cell culture selection. Mol Plant-Microbe Interact. 1997;10(3):307-315. doi 10.1094/MPMI.1997.10.3.307

15. Hu C.Y., Chee P.P., Chesney R.H., Zhou J.H., Miller P.D., O’Brien W.T. Intrinsic GUS-like activities in seed plants. Plant Cell Rep. 1990; 9(1):1-5. doi 10.1007/BF00232123

16. Joshi M., Timilsena Y., Adhikari B. Global production, processing and utilization of lentil: a review. J Integr Agric. 2017;16(12):2898-2913. doi 10.1016/S2095-3119(17)61793-3

17. Kaale L.D., Siddiq M., Hooper S. Lentil (Lens culinaris Medik) as nutrient-rich and versatile food legume: a review. Legume Sci. 2023; 5(2):e169. doi 10.1002/leg3.169

18. Karimi M., Inzé D., Depicker A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 2002;7(5): 193-195. doi 10.1016/S1360-1385(02)02251-3

19. Khatib F., Makris A., Yamaguchi-Shinozaki K., Kumar S., Sarker A., Erskine W., Baum M. Expression of the DREB1A gene in lentil (Lens culinaris Medik. subsp. culinaris) transformed with the Agrobacterium system. Crop Pasture Sci. 2011;62(6):488-495. doi 10.1071/CP10351

20. Kumar J., Gela T.S., Gupta D.S., Chandra A., Khazaei H. Recent advances in lentil genetics, genomics, and molecular breeding. In: Lentils: Production, Processing Technologies, Products, and Nutritional Profile. Hoboken: John Wiley & Sons Ltd., 2023;25-43. doi 10.1002/9781119866923.ch2

21. Li G., Liu R., Xu R., Varshney R.K., Ding H., Li M., Yan X., … Luo Y., Gao S., Wei P., Zong X., Yang T. Development of an Agrobacteriummediated CRISPR/Cas9 system in pea (Pisum sativum L.). Crop J. 2023;11(1):132-139. doi 10.1016/j.cj.2022.04.011

22. Liber M., Duarte I., Maia A.T., Oliveira H.R. The history of lentil (Lens culinaris subsp. culinaris) domestication and spread as revealed by genotyping-by-sequencing of wild and landrace accessions. Front Plant Sci. 2021;12:628439. doi 10.3389/fpls.2021.628439

23. Lurquin P.F., Cai Z., Stiff C.M., Fuerst E.P. Half-embryo cocultivation technique for estimating the susceptibility of pea (Pisum sativum L.) and lentil (Lens culinaris Medik.) cultivars to Agrobacterium tumefaciens. Mol Biotechnol. 1998;9(2):175-179. doi 10.1007/BF02760819

24. Mahmoudian M., Yücel M., Öktem H.A. Transformation of lentil (Lens culinaris M.) cotyledonary nodes by vacuum infiltration of Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol Biol Rep. 2002;20(3):251-257. doi 10.1007/BF02782460

25. Meyer D., Zeileis A., Hornik K. The strucplot framework: visualizing multi-way contingency tables with vcd. J Statistical Software. 2006; 17(3):1-48. doi 10.18637/jss.v017.i03

26. Meyer D., Zeileis A., Hornik K., Friendly M. vcd: visualizing categorical data. R package version 1.4-12. 2024. URL: https://CRAN.Rproject.org/package=vcd

27. Muhitch M.J. Characterization of pedicel β-glucuronidase activity in developing maize (Zea mays) kernels. Physiol Plant. 1998;104(3): 423-430. doi 10.1034/j.1399-3054.1998.1040318.x

28. Noack F., Engist D., Gantois J., Gaur V., Hyjazie B.F., Larsen A., M’Gonigle L.K., Missirian A., Qaim M., Sargent R.D., Souza-Rodrigues E., Kremen C. Environmental impacts of genetically modified crops. Science. 2024;385(6712):eado9340. doi 10.1126/science.ado9340

29. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A. Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method. Planta. 2003;216(5):723-735. doi 10.1007/s00425-002-0922-2

30. Polanco M.C., Peláez M.I., Ruiz M.L. Factors affecting callus and shoot formation from in vitro cultures of Lens culinaris Medik. Plant Cell Tissue Organ Cult. 1988;15(2):175-182. doi 10.1007/BF00035759

31. Polowick P.L., Yan W. A protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of Lens culinaris Medik (lentil). Plant Cell Tissue Organ Cult. 2023;152(3):605-618. doi 10.1007/s11240-022-02434-x

32. Potsenkovskaia E., Tvorogova V., Yakovleva D., Zlydneva N., Lutova L. Novel NF-Y genes expressed during somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plant Gene. 2022;31:100364. doi 10.1016/j.plgene.2022.100364

33. Runte M., Guth J.N., Ammann J. Consumers’ perception of plant-based alternatives and changes over time. A linguistic analysis across three countries and ten years. Food Qual Preference. 2024;113:105057. doi 10.1016/j.foodqual.2023.105057

34. Sudan C., Prakash S., Bhomkar P., Jain S., Bhalla-Sarin N. Ubiquitous presence of β-glucuronidase (GUS) in plants and its regulation in some model plants. Planta. 2006;224(4):853-864. doi 10.1007/s00425-006-0276-2

35. Tisseyre P., Cartieaux F., Chabrillange N., Gully D., Hocher V., Svistoonoff S., Gherbi H. Setting up Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of the tropical legume Aeschynomene evenia, a powerful tool for studying gene function in nod factor-independent symbiosis. PLoS One. 2024;19(4):e0297547. doi 10.1371/journal.pone.0297547

36. Tvorogova V.E., Fedorova Y.A., Potsenkovskaya E.A., Kudriashov A.A., Efremova E.P., Kvitkovskaya V.A., Wolabu T.W., Zhang F., Tadege M., Lutova L.A. The WUSCHEL-related homeobox transcription factor MtWOX9-1 stimulates somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2019;138(3): 517-527. doi 10.1007/s11240-019-01648-w

37. Warkentin T.D., McHughen A. Agrobacterium tumefaciens-mediated beta-glucuronidase (GUS) gene expression in lentil (Lens culinaris Medik.) tissues. Plant Cell Rep. 1992;11(5-6):274-278. doi 10.1007/BF00235081

38. Wickham H., François R., Henry L., Müller K., Vaughan D. dplyr: a grammar of data manipulation. R package version 1.1.4. 2025. URL: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr

39. Wu H.-Y., Liu K.-H., Wang Y.-C., Wu J.-F., Chiu W.-L., Chen C.-Y., Wu S.-H., Sheen J., Lai E.-M. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant Methods. 2014; 10(1):19. doi 10.1186/1746-4811-10-19

40. Yakovleva D., Efremova E., Smirnov K., Simonova V., Konstantinov Z., Tvorogova V., Lutova L. The WOX genes from the intermediate clade: influence on the somatic embryogenesis in Medicago truncatula. Plants. 2024;13(2):223. doi 10.3390/plants13020223

41. Zuo X., Li P., Ren G., Bai Z., Jiang D., Liu C. Functional characterization of β-glucuronidase genes involved in baicalein biosynthesis from Scutellaria baicalensis based on transcriptome analysis. Int J Mol Sci. 2025;26(5):4410. doi 10.3390/ijms26051793