Получение линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток RCPCMi014-A и RCPCMi014-B из Т-лимфоцитов здорового донора и верификация их моноклонального происхождения по V(D)J-перестройкам генов TCR

Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из Т-лимфоцитов периферической крови представляет собой перспективную альтернативу использованию фибробластов кожи. Этот подход сочетает минимально инвазивный забор биоматериала совместно с быстрым получением обогащенной популяции целевых клеток. Дополнительным преимуществом является относительно низкий мутационный груз T-лимфоцитов по сравнению с традиционным источником соматических клеток для репрограммирования – фибробластами кожи, ввиду того что Т-лимфоциты защищены от хронического воздействия ультрафиолетового излучения – одного из ключевых факторов накопления соматических мутаций. Объективная верификация моноклональности полученных линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток возможна благодаря наличию V(D)J-перестроек генов Т-клеточного рецептора, формирующихся в результате соматической рекомбинации в тимусе в процессе естественного созревания Т-лимфоцитов. Эти перестройки остаются неизменными при репрограммировании и служат уникальным маркером, позволяющим достоверно идентифицировать моноклональные линии и исключать контаминированные линии или линии поликлонального происхождения. Надежная верификация клонального происхождения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток может быть важной в экспериментах, предъявляющих высокие требования к генетической однородности. Данная работа посвящена созданию и комплексной характеристике моноклональных линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из CD3+ Т-лимфоцитов здорового донора методом эписомного репрограммирования. Полученные линии RCPCMi014-A (PBM022E5) и RCPCMi014-B (PBM022E7) соответствуют принятым критериям качества для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток: они демонстрируют экспрессию ключевых маркеров плюрипотентности (OCT4, SOX2, SSEA-4, TRA-1-81), способность к дифференцировке в производные всех трех зародышевых листков и обладают нормальным кариотипом. Обе линии показали способность к дифференцировке в дефинитивную эндодерму с высокой эффективностью, оцененной по экспрессии CXCR4, что определяет их перспективность для разработки протоколов генерации β-клеток поджелудочной железы. Полученные линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток могут быть использованы для фундаментальных исследований механизмов плюрипотентности и дифференцировки, а также для создания изогенных линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с внесенными мутациями при моделировании редких наследственных заболеваний.

1. Alt F.W., Oltz E.M., Young F., Gorman J., Taccioli G., Chen J. VDJ recombination. Immunol Today. 1992;13(8):306-314. doi 10.1016/0167-5699(92)90043-7

2. Bogomiakova M.E., Sekretova E.K., Eremeev A.V., Shuvalova L.D., Bobrovsky P.A., Zerkalenkova E.A., Lebedeva O.S., Lagarkova M.A. Derivation of induced pluripotent stem cells line (RCPCMi007-A-1) with inactivation of the beta-2-microglobulin gene by CRISPR/Cas9 genome editing. Stem Cell Res. 2021;55:102451. doi 10.1016/J.SCR.2021.102451

3. Cerneckis J., Cai H., Shi Y. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): molecular mechanisms of induction and applications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):112. doi 10.1038/S41392-024-01809-0

4. Fedorenko A.V., Khomyakova E.A., Surdina A.V., Sekretova E.K., Limanskaya T.V., Belikova L.D., Volovikov E.A., … Fedotov D.A., Zerkalenkova E.A., Lagarkova M.A., Lebedev I.N., Bogomazova A.N. Design of iPSC-based cell model to study the functions of the UBE2A gene. Genes and Cells. 2024;19(2):297-313. doi 10.17816/GC623799 (in Russian)

5. Goliusova D.V., Lebedeva O.S., Sharikova M.Y., Kopylova I.V., Teryakova M.V., Lavrenteva K.A., Zerkalenkova E.A., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A. Derivation of RCPCMi011-A induced pluripotent stem cell line from fibroblasts of a patient with restrictive cardiomyopathy caused by c.7416_7418delGAA mutation in the FLNC gene. Russ J Dev Biol. 2024;55(6):347-355. doi 10.1134/S1062360425700055

6. Goliusova D.V., Bogomolova A.P., Davidenko A.V., Lavrenteva K.A., Sharikova M.Y., Zerkalenkova E.A., Vassina E.M., Bogomazova A.N., Lagarkova M.A., Katrukha I.A., Lebedeva O.S. Metabolic culture medium enhances maturation of human iPSC-derived cardiomyocytes via cardiac troponin I isoform induction. Int J Mol Sci. 2025;26(15):7248. doi 10.3390/IJMS26157248/S1

7. Grigor’eva E.V., Kopytova A.E., Yarkova E.S., Pavlova S.V., Sorogina D.A., Malakhova A.A., Malankhanova T.B., Baydakova G.V., Zakharova E.Y., Medvedev S.P., Pchelina S.N., Zakian S.M. Biochemical characteristics of iPSC-derived dopaminergic neurons from N370S GBA variant carriers with and without Parkinson’s disease. Int J Mol Sci. 2023;24(5). doi 10.3390/IJMS24054437

8. Grigor’eva E.V., Malakhova A.A., Yarkova E.S., Minina J.M., Vyatkin Y.V., Nadtochy J.A., Khabarova E.A., Rzaev J.A., Medvedev S.P., Zakian S.M. Generation and characterization of two induced pluripotent stem cell lines (ICGi052-A and ICGi052-B) from a patient with frontotemporal dementia with parkinsonism-17 associated with the pathological variant c.2013T>G in the MAPT gene. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov J Gen Breed. 2024;28(7):679-687. doi 10.18699/VJGB-24-76

9. Harbut E., Makris Y., Pertsemlidis A., Bleris L. The history, landscape, and outlook of human cell line authentication and security. SLAS Discov. 2024;29(8):100194. doi 10.1016/J.SLASD.2024.100194

10. Kishino Y., Seki T., Fujita J., Yuasa S., Tohyama S., Kunitomi A., Tabei R., Nakajima K., Okada M., Hirano A., Kanazawa H., Fukuda K. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 2014;9(5):e97397. doi 10.1371/journal.pone.0097397

11. Khomyakova E.A., Fedorenko A.V., Surdina A.V., Volovikov E.A., Belikova L.D., Zerkalenkova E.A., Lagarkova M.A., BogomazovaA.N. Derivation of induced pluripotent stem cells line (RCPCMi009-A-1) with knockout of the UBE2A gene by using CRISPR/Cas9 genome editing. Russ J Dev Biol. 2023;54(6):365-373. doi 10.1134/S1062360423060048

12. Kreslavsky T., Garbe A., Krueger A., von Boehmer H. T cell receptorinstructed alphabeta versus gammadelta lineage commitment revealed by single-cell analysis. J Exp Med. 2008;205(5):1173-1186. doi 10.1084/jem.20072425

13. Kreslavsky T., Gleimer M., von Boehmer H. Alphabeta versus gammadelta lineage choice at the first TCR-controlled checkpoint. Curr Opin Immunol. 2010;22(2):185-192. doi 10.1016/j.coi.2009.12.006

14. Mahe E., Pugh T., Kamel-Reid S. T cell clonality assessment: past, present and future. J Clin Pathol. 2018;71(3):195-200. doi 10.1136/jclinpath-2017-204761

15. Martin A.R., Williams E., Foulger R.E., Leigh S., Daugherty L.C., Niblock O., Leong I.U.S., … Kasperaviciute D., Smedley D., Caulfield M., Rendon A., McDonagh E.M. PanelApp crowdsources expert knowledge to establish consensus diagnostic gene panels. Nat Genet. 2019;51(11):1560-1565. doi 10.1038/S41588-019-0528-2

16. Maslennikova A., Kruglova N., Kalinichenko S., Komkov D., Shepelev M., Golubev D., Siniavin A., Vzorov A., Filatov A., Mazurov D. Engineering T-cell resistance to HIV-1 infection via knock-in of peptides from the heptad repeat 2 domain of gp41. mBio. 2022; 13(1):e0358921. doi 10.1128/mbio.03589-21

17. Mills J.A., Wang K., Paluru P., Ying L., Lu L., Galvão A.M., Xu D., … Mostoslavsky G., Kotton D.N., French D.L., Weiss M.J., Gadue P. Clonal genetic and hematopoietic heterogeneity among human-induced pluripotent stem cell lines. Blood. 2013;122(12):2047-2051. doi 10.1182/blood-2013-02-484444

18. Nishimura T., Kaneko S., Kawana-Tachikawa A., Tajima Y., Goto H., Zhu D., Nakayama-Hosoya K., … Iwamoto A., Koseki H., Nakanishi M., Eto K., Nakauchi H. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 2013;12(1):114-126. doi 10.1016/j.stem.2012.11.002

19. Okita K., Yamakawa T., Matsumura Y., Sato Y., Amano N., Watanabe A., Goshima N., Yamanaka S. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 2013;31(3):458- 466. doi 10.1002/stem.1293

20. Podvysotskaya V.S., Grigor’eva E. V., Malakhova A.A., Minina J.M., Vyatkin Y. V., Khabarova E.A., Rzaev J.A., Medvedev S.P., Kovalenko L. V., Zakian S.M. Generation and characterisation of seven induced pluripotent stem cell lines from two patients with Parkinson’s disease carrying the pathological variant c.1087G>T of the LGR4 gene. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov J Gen Breed. 2025;29(1):15-25. doi 10.18699/VJGB-25-03

21. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W.W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K., Rehm H.L. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Gen Med. 2015;17(5):405-424. doi 10.1038/gim.2015.30

22. Seki T., Yuasa S., Oda M., Egashira T., Yae K., Kusumoto D., Nakata H., … Okada Y., Seimiya H., Fusaki N., Hasegawa M., Fukuda K. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating t cells. Cell Stem Cell. 2010;7(1):11-14. doi 10.1016/j.stem.2010.06.003

23. Sherwood A., Desmarais C., Livingston R., Andriesen J., Haussler M., Carlson C., Robins H. Deep sequencing of the human TCRγ and TCRβ repertoires suggests that TCRβ rearranges after αβ and γδ T cell commitment. Sci Transl Med. 2011;3(90):90ra61. doi 10.1126/scitranslmed.3002536

24. Summers R.A., Fagiani F., Rowitch D.H., Absinta M., Reich D.S. Novel human iPSC models of neuroinflammation in neurodegenerative disease and regenerative medicine. Trends Immunol. 2024; 45(10):799-813. doi 10.1016/j.it.2024.08.004

25. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-172. doi 10.1016/j.cell.2007.11.019

26. Vlasov I.N., Alieva A.K., Novosadova E.V., Arsenyeva E.L., Rosinskaya A.V., Partevian S.A., Grivennikov I.A., Shadrina M.I. Transcriptome analysis of induced pluripotent stem cells and neuronal progenitor cells, derived from discordant monozygotic twins with Parkinson’s disease. Cells. 2021;10(12):3478. doi 10.3390/cells10123478

27. Watanabe T., Yamazaki S., Yoneda N., Shinohara H., Tomioka I., Higuchi Y., Yagoto M., Ema M., Suemizu H., Kawai K., Sasaki E. Highly efficient induction of primate iPS cells by combining RNA transfection and chemical compounds. Genes Cells. 2019;24(7):473-484. doi 10.1111/gtc.12702

28. Willmann C.A., Hemeda H., Pieper L.A., Lenz M., Qin J., Joussen S., Sontag S., Wanek P., Denecke B., Schüler H.M., Zenke M., Wagner W. To clone or not to clone? Induced pluripotent stem cells can be generated in bulk culture. PLoS One. 2013;8(5):e65324. doi 10.1371/journal.pone.0065324

29. Yamanaka S. Pluripotent stem cell-based cell therapy – promise and challenges. Cell Stem Cell. 2020;27(4):523-531. doi 10.1016/j.stem.2020.09.014

30. Yun J., So J., Jeong S., Jang J., Han S., Jeon J., Lee K., Jang H.R., Lee J. Transcriptome and epigenome dynamics of the clonal heterogeneity of human induced pluripotent stem cells for cardiac differentiation. Cell Mol Life Sci. 2025;82(1):2. doi 10.1007/S00018-024-05493-9