Создание растений картофеля (Solanum tuberosum L.) с инактивированным геном StPain-1 с помощью CRISPR/Cas9

Холодовое хранение клубней картофеля для последующей переработки осложнено развитием холодового осахаривания. При пониженной температуре происходит реакция ферментативного гидролиза сахарозы на глюкозу и фруктозу. Как следствие, высокое содержание гексоз негативно сказывается на качестве продуктов переработки картофеля – чипсов и фри, а также способствует образованию нейротоксина и канцерогена акриламида. Гидролиз сахарозы в процессе холодового осахаривания катализирует вакуолярная инвертаза, кодируемая геном StPain-1. Ранее было показано, что подавление активности фермента придает картофелю устойчивость к холодовому осахариванию, не снижая при этом питательных качеств клубней. В настоящей работе с помощью CRISPR/Cas9 были созданы растения культурного картофеля Solanum tuberosum L. сорта Фрителла с нокаутом гена StPain-1. Для редактирования целевого гена были собраны две генетические конструкции на основе вектора pKSE401 (Вектор A и Вектор B), каждая из которых несла две гидовые РНК: на участки в первом (sgRNA-P1.A и sgRNA-P1.B) и третьем (sgRNA-P3.A и sgRNA-P3.B) экзонах. Эффективность редактирования каждой gRNA была охарактеризована с применением высокопроизводительного секвенирования. С конструкцией Вектор A получено 48 трансформантов, среди которых 22 содержали нокаут всех аллелей гена StPain-1; с конструкцией Вектор B – 26 трансформантов, из них 10 были с нокаутом. Путем обжарки чипсов из клубней девяти отредактированных растений картофеля сорта Фрителла было наглядно продемонстрировано снижение активности вакуолярной инвертазы. Чипсы из образцов с нокаутом гена StPain-1 имели более светлую окраску, чем чипсы из контрольного образца без редактирования. По результатам проведенной работы отобрано четыре растения с нокаутом гена StPain-1, по два для каждой конструкции, для которых количественная оценка глюкозы, фруктозы и сахарозы, а также измерение уровня мРНК подтвердили инактивацию фермента. Полученные растения обладают повышенной устойчивостью к холодовому осахариванию и являются перспективными источниками нефункциональных аллелей гена StPain-1 для селекции новых сортов картофеля.

1. Abbas A., Shah A.N., Shah A.A., Nadeem M.A., Alsaleh A., Javed T., Alotaibi S.S., Abdelsalam N.R. Genome-wide analysis of invertase gene family, and expression profiling under abiotic stress conditions in potato. Biology (Basel). 2022;11(4):539. doi 10.3390/biology11040539

2. Bhaskar P.B., Wu L., Busse J.S., Whitty B.R., Hamernik A.J., Jansky S.H., Buell C.R., Bethke P.C., Jiang J. Suppression of the vacuolar invertase gene prevents cold-induced sweetening in potato. Plant Physiol. 2010;154(2):939-948. doi 10.1104/pp.110.162545

3. Biedermann-Brem S., Noti A., Grob K., Imhof D., Bazzocco D., Pfefferle A. How much reducing sugar may potatoes contain to avoid excessive acrylamide formation during roasting and baking? Eur Food Res Technol. 2003;217:369-373. doi 10.1007/s00217-003-0779-z

4. Blenkinsop R.W., Yada R.Y., Marangoni A.G. Metabolic control of low-temperature sweetening in potato tubers during postharvest storage. Hortic Rev. 2003;30:317-354. doi 10.1002/9780470650837.ch8

5. Bruno F., Hein I., Jorat M.E., Ledbetter M., Harrower B., Davies B., Sturrock K., Montague G., Knott M., McNamara G., Fiore A. Effects of agronomical practices on potato growth, nutritional profile, and suitability for frying. J Sci Food Agric. 2025;105(7):3983-3992. doi 10.1002/jsfa.14147

6. Clasen B.M., Stoddard T.J., Luo S., Demorest Z.L., Li J., Cedrone F., Tibebu R., … Haun W., Baltes N.J., Mathis L., Voytas D.F., Zhang F. Improving cold storage and processing traits in potato through targeted gene knockout. Plant Biotechnol J. 2016;14:169-176. doi 10.1111/pbi.12370

7. Clement K., Rees H., Canver M.C., Gehrke J.M., Farouni R., Hsu J.Y., Cole M.A., Liu D.R., Joung J.K., Bauer D.E., Pinello L. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-226. doi 10.1038/s41587-019-0032-3

8. Concordet J.-P., Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W242-W245. doi 10.1093/nar/gky354

9. Davies H.V., Jefferies R.A., Scobie L. Hexose accumulation in cold-stored tubers of potato (Solanum tuberosum L.): the effects of water stress. J Plant Physiol. 1989;134(4):471-475. doi 10.1016/S0176-1617(89)80012-4

10. Draffehn A.M., Meller S., Li L., Gebhardt C. Natural diversity of potato (Solanum tuberosum) invertases. BMC Plant Biol. 2010;10:271. doi 10.1186/1471-2229-10-271

11. Egorova A.A., Zykova T.E., Kostina N.E., Saboiev I.A., Koloshina K.A., Filipenko E.A., Hoffie I., Hertig C., Hiekel S., Kumlehn J., Kochetov A.V., Gerasimova S.V. Reduction in cold-induced sweetening by Cas9 endonuclease-mediated knockout of the POTATO VACUOLAR INVERTASE 1 gene in the cultivar ‘Symfonia.’ Potato Res. 2025;68:1571-1593. doi 10.1007/s11540-024-09800-6

12. Ewels P., Magnusson M., Lundin S., Käller M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 2016;32:3047-3048. doi 10.1093/bioinformatics/btw354

13. Greiner S., Rausch T., Sonnewald U., Herbers K. Ectopic expression of a tobacco invertase inhibitor homolog prevents cold-induced sweetening of potato tubers. Nat Biotechnol. 1999;17:708-711. doi 10.1038/10924

14. Kulakova A.V., Efremov G.I., Shchennikova A.V., Kochieva E.Z. Dependence of the content of starch and reducing sugars on the level of expression of the genes of β-amylases StBAM1 and StBAM9 and the amylase inhibitor StAI during long-term low-temperature storage of potato tubers. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov J Genet Breed. 2022;26(6):507-514. doi 10.18699/VJGB-22-62

15. Lebedeva M., Komakhin R., Konovalova L., Ivanova L., Taranov V., Monakhova Y., Babakov A., Klepikova A., Zlobin N. Development of potato (Solanum tuberosum L.) plants with StLEAFY knockout. Planta. 2022;256:116. doi 10.1007/s00425-022-04032-9

16. Lei Y., Lu L., Liu H.-Y., Li S., Xing F., Chen L.-L. CRISPR-P: a web tool for synthetic single-guide RNA design of CRISPR-system in plants. Mol Plant. 2014;7(9):1494-1496. doi 10.1093/mp/ssu044

17. Ly D.N.P., Iqbal S., Fosu-Nyarko J., Milroy S., Jones M.G. Multiplex CRISPR-Cas9 gene-editing can deliver potato cultivars with reduced browning and acrylamide. Plants (Basel). 2023;12(2):379. doi 10.3390/plants12020379

18. Madeira F., Madhusoodanan N., Lee J., Eusebi A., Niewielska A., Tivey A.R.N., Lopez R., Butcher S. The EMBL-EBI Job Dispatcher sequence analysis tools framework in 2024. Nucleic Acids Res. 2024;52(W1):W521-W525. doi 10.1093/nar/gkae241

19. Massa G.A., Décima Oneto C.A., González M.N., Poulsen Hornum A., Arizmendi A., Sucar S., Divito S.B., Feingold S.E. CRISPR/Cas9-mediated development of potato varieties with long-term cold storage and bruising resistance. Biology (Basel). 2025;14(4):445. doi 10.3390/biology14040445

20. McKenzie M.J., Chen R.K.Y., Harris J.C., Ashworth M.J., Brummell D.A. Post-translational regulation of acid invertase activity by vacuolar invertase inhibitor affects resistance to cold-induced sweetening of potato tubers. Plant Cell Environ. 2013;36(1): 176-185. doi 10.1111/j.1365-3040.2012.02565.x

21. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962;15(3): 473-497. doi 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

22. Murata M. Browning and pigmentation in food through the Maillard reaction. Glycoconj J. 2021;38:283-292. doi 10.1007/s10719-020-09943-x

23. Nicot N., Hausman J.-F., Hoffmann L., Evers D. Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress. J Exp Bot. 2005;56(421):2907-2914. doi 10.1093/jxb/eri285

24. Osipov V.S., Zeldner A.G. Potato production in Russia and Ukraine. In: Çalişkan M.E., Bakhsh A., Jabran K. (Eds) Potato Production Worldwide. Academic Press, 2023;341-363. doi 10.1016/B978-0-12-822925-5.00023-2

25. Pham G.M., Newton L., Wiegert-Rininger K., Vaillancourt B., Douches D.S., Buell C.R. Extensive genome heterogeneity leads to preferential allele expression and copy number-dependent expression in cultivated potato. Plant J. 2017;92(4):624-637. doi 10.1111/tpj.13706

26. Richardson D.L., Davies H.V., Ross H.A., Mackay G.R. Invertase activity and its relation to hexose accumulation in potato tubers. J Exp Bot. 1990;41(1):95-99. doi 10.1093/jxb/41.1.95

27. Shumbe L., Soares E., Muhovski Y., Smit I., Vanderschuren H. Mutation of the Vinv 5′ UTR regulatory region reduces acrylamide levels in processed potato to reach EU food-safety standards. Plant Biotechnol J. 2024;22(10):2738-2740. doi 10.1111/pbi.14400

28. Siaw M.O., Ofosu I.W., Lutterodt H.E., Ankar-Brewoo G.M. Acryl-amide exposure and risks in most frequently consumed foods in a total diet study. Am J Food Sci Technol. 2018;6(4):123-137. doi 10.12691/ajfst-6-4-1

29. Simakov E.A., Anisimov B.V., Mityushkin А.V., Zhuravlev A.A. Varietal resources for intended potato growing. Kartofel’ i Ovoshсhi = Potato and Vegetables. 2017;11:24-26 (in Russian)

30. Slugina M.A., Kochieva E.Z. Variability of a fragment of the acid vacuolar invertase Pain-1 gene in potato cultivars. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov J Genet Breed. 2014;18(4/1):718-723 (in Russian)

31. Tareke E., Rydberg P., Karlsson P., Eriksson S., Törnqvist M. Analysis of acrylamide, a carcinogen formed in heated foodstuffs. J Agric Food Chem. 2002;50(17):4998-5006. doi 10.1021/jf020302f

32. Teper-Bamnolker P., Roitman M., Katar O., Peleg N., Aruchamy K., Suher S., Doron-Faigenboim A., … Fält A., Volpin H., Hofvander P., Gal-On A., Eshel D. An alternative pathway to plant cold tolerance in the absence of vacuolar invertase activity. Plant J. 2023;113(2): 327-341. doi 10.1111/tpj.16049

33. Toufiq N., Adeyinka O.S., Khan A., Shafique S., Jahan N., Bhatti M.U., Khalid R., Naeem A., Abbas Q., Shafique S., Tabassum B. Multiple transgenic strategies positively regulate cold-induced sweetening in low temperature stored potato tubers. Potato Res. 2025;68:69-88. doi 10.1007/s11540-024-09733-0

34. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3(7):research0034. doi 10.1186/gb-2002-3-7-research0034

35. Vetchinkina E.M., Komakhina V.V., Vysotskii D.A., Zaitsev D.V., Smirnov A.N., Babakov A.V., Komakhin R.A. Expression of plant antimicrobial peptide pro-SmAMP2 gene increases resistance of transgenic potato plants to Alternaria and Fusarium pathogens. Russ J Genet. 2016;52:939-951. doi 10.1134/S1022795416080147

36. Wu L., Bhaskar P.B., Busse J.S., Zhang R., Bethke P.C., Jiang J. Developing cold-chipping potato varieties by silencing the vacuolar invertase gene. Crop Sci. 2011;51(3):981-990. doi 10.2135/cropsci2010.08.0473

37. Wustman R., Struik P.C. The canon of potato science: 35. Seed and ware potato storage. Potato Res. 2007;50:351-355. doi 10.1007/s11540-008-9079-0

38. Xing H.-L., Dong L., Wang Z.-P., Zhang H.-Y., Han C.-Y., Liu B., Wang X.-C., Chen Q.-J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014;14:327. doi 10.1186/s12870-014-0327-y

39. Yasmeen A., Shakoor S., Azam S., Bakhsh A., Shahid N., Latif A., Shahid A.A., Husnain T., Rao A.Q. CRISPR/Cas-mediated knock-down of vacuolar invertase gene expression lowers the cold-induced sweetening in potatoes. Planta. 2022;256:107. doi 10.1007/s00425-022-04022-x

40. Zhang C., Xie C., Song B., Liu X., Liu J. RNAi effects on regulation of endogenous acid invertase activity in potato (Solanum tuberosum L.) tubers. Chin J Agric Biotechnol. 2008;5(2):107-112. doi 10.1017/S1479236208002192

41. Zhu X., Richael C., Chamberlain P., Busse J.S., Bussan A.J., Jiang J., Bethke P.C. Vacuolar invertase gene silencing in potato (Solanum tuberosum L.) improves processing quality by decreasing the frequency of sugar-end defects. PLoS One. 2014;9:e93381. doi 10.1371/journal.pone.0093381

42. Zhu X., Chen A., Butler N.M., Zeng Z., Xin H., Wang L., Lv Z., Eshel D., Douches D.S., Jiang J. Molecular dissection of an intronic enhancer governing cold-induced expression of the vacuolar invertase gene in potato. Plant Cell. 2024;36(5):1985-1999. doi 10.1093/plcell/koae050

43. Zrenner R., Schöler K., Sonnewald U. Soluble acid invertase determines the hexose-to-sucrose ratio in cold-stored potato tubers. Planta. 1996;198(2):246-252. doi 10.1007/BF00206250