Анализ влияния интронных вариантов c.940+3_940+6del, c.941-3C>G и c.2389+5G>A гена LDLR на сплайсинг пре-мРНК с использованием системы минигенов

Семейная гиперхолестеринемия (СГХС) – аутосомно-кодоминантное заболевание, характеризующееся нарушением выведения липопротеинов низкой плотности из кровотока, выраженным повышением уровня общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности в крови и ранним развитием атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний. СГХС является наиболее распространенным моногенным заболеванием у человека. Самые частые причины развития заболевания – мутации в трех генах: LDLR (OMIM: 143890), APOB (OMIM: 107730) и PCSK9 (OMIM: 607786). Более 80 % случаев СГХС обусловлено патогенными вариантами гена LDLR, локализованного на хромосоме 19. У 25–75 % пациентов с фенотипом СГХС патогенный вариант в указанных генах не обнаруживается. Полноэкзомное и таргетное секвенирование генов LDLR, APOB, PCSK9, LDLRAP1 было проведено у пациентов с фенотипом СГХС с последующим подтверждением выявленных вариантов секвенированием по методу Сэнгера. У трех неродственных пробандов обнаружены интронные варианты гена LDLR, для которых ранее не проводилась функциональная верификация. Целью работы стала функциональная оценка in vitro влияния трех интронных вариантов гена LDLR (NM_000527.5: c.940+3_940+6del, c.941-3C>G, c.2389+5G>A) на процесс сплайсинга с использованием генетических конструкций – минигенов. Для функциональной верификации in vitro были созданы минигены, включающие исследуемые экзоны с фланкирующими интронными областями. Анализ сплайсинга проводили в клеточных линиях HEK293 и HeLa. В результате анализа подтвержден патогенный эффект всех трех выявленных вариантов на сплайсинг пре-мРНК. Делеция четырех нуклеотидов c.940+3_940+6del приводила к образованию двух аберрантных транскриптов – включению шести нуклеотидов интрона 6, а также к полному удержанию интронной последовательности минигена. Вариант c.941-3C>G обусловливал потерю акцепторного сайта сплайсинга и активацию криптического, с включением нуклеотидов интрона 6. Замена c.2389+5G>A  приводила к пропуску экзона 16. Функциональный анализ in vitro – ключевой инструмент молекулярной верификации интронных вариантов с неопределенной клинической значимостью и в совокупности с клиническими данными помогает в установлении окончательного диагноза.

1. Abramowicz A., Gos M. Splicing mutations in human genetic disorders: examples, detection, and confirmation. J Appl Genet. 2018;59(3): 253-268. doi 10.1007/s13353-018-0444-7

2. Ahmad Z., Agarwala A., Cuchel M., Barton Duell P., Hegele R.A., Hudgins L., Jamison A., … Soffer D.E., Warden B.A., Weintraub W.S., Williams L., Goldberg A.C. Update on familial hypercholesterol emia: an expert clinical consensus from the National Lipid Asso ciation. J Clin Lipidol. 2026;20(4):708-737. doi 10.1016/j.jacl.2026.01.011

3. Amsellem S., Briffaut D., Carrié A., Rabès J.P., Girardet J.P., Fredenrich A., Moulin P., Krempf M., Reznik Y., Vialettes B., de Gennes J.L., Brukert E., Benlian P. Intronic mutations outside of Alu-repeat-rich domains of the LDL receptor gene are a cause of familial hypercholesterolemia. Hum Genet. 2002;111(6):501-510. doi 10.1007/s00439-002-0813-4

4. Austin M.A., Hutter C.M., Zimmern R.L., Humphries S.E. Genetic causes of monogenic heterozygous familial hypercholesterolemia: a HuGE prevalence review. Am J Epidemiol. 2004;160(5):407-420. doi 10.1093/aje/kwh236

5. Benito-Vicente A., Alves A.C., Etxebarria A., Medeiros A.M., Martin C., Bourbon M. The importance of an integrated analysis of clinical, molecular, and functional data for the genetic diagnosis of familial hypercholesterolemia. Genet Med. 2015;17(12):980-988. doi 10.1038/gim.2015.14

6. Blakes A.J.M., Wai H.A., Davies I., Moledina H.E., Ruiz A., Thomas T., Bunyan D., … Douglas A.G.L.; Genomics England Research Consortium, Splicing and Disease Working Group; Whiffin N., Baralle D., Lord J. A systematic analysis of splicing variants identifies new diagnoses in the 100,000 Genomes Project. Genome Med. 2022;14(1):79. doi 10.1186/s13073-022-01087-x

7. Bourbon M., Duarte M.A., Alves A.C., Medeiros A.M., Marques L., Soutar A.K. Genetic diagnosis of familial hypercholesterolaemia: the importance of functional analysis of potential splice-site mutations. J Med Genet. 2009;46(5):352-357. doi 10.1136/jmg.2007.057000

8. Brown M.S., Goldstein J.L. Receptor-mediated endocytosis: insights from the lipoprotein receptor system. Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76(7):3330-3337. doi 10.1073/pnas.76.7.3330

9. Chong R., Insigne K.D., Yao D., Burghard C.P., Wang J., Hsiao Y.E., Jones E.M., Goodman D.B., Xiao X., Kosuri S. A multiplexed assay for exon recognition reveals that an unappreciated fraction of rare genetic variants cause large-effect splicing disruptions. Mol Cell. 2019;73(1):183-194.e8. doi 10.1016/j.molcel.2018.10.037

10. Chora J.R., Iacocca M.A., Tichý L., Wand H., Kurtz C.L., Zimmermann H., Leon A., … Hegele R.A., Freiberger T., Knowles J.W., Bourbon M.; ClinGen Familial Hypercholesterolemia Expert Panel. The Clinical Genome Resource (ClinGen) Familial Hypercholesterolemia Variant Curation Expert Panel consensus guidelines for LDLR variant classification. Genet Med. 2022;24(2):293-306. doi 10.1016/j.gim.2021.09.012

11. Cooper T.A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 2005;37(4):331-340. doi 10.1016/j.ymeth.2005. 07.015

12. Etxebarria A., Palacios L., Stef M., Tejedor D., Uribe K.B., Oleaga A., Irigoyen L., Torres B., Ostolaza H., Martin C. Functional characterization of splicing and ligand-binding domain variants in the LDL receptor. Hum Mutat. 2012;33(1):232-243. doi 10.1002/humu.21630

13. Ezhov M.V., Bazhan S.S., Ershova A.I., Meshkov A.N., Sokolov A.A., Kukharchuk V.V., Gurevich V.S., … Balakhonova T.V., Filippov A.E., Akhmejanov N.M., Aleksandrova O.Yu., Lipovetskiy B.M. Clinical guidelines for familial hypercholesterolemia. Ateroscleroz. 2019;15(1):58-98 (in Russian)

14. Freiberger T. Update on genetics of familial hypercholesterolemia. Curr Opin Lipidol. 2026;37(2):38-44. doi 10.1097/MOL.0000000000001027

15. Hobbs H.H., Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. The LDL receptor locus in familial hypercholesterolemia: mutational analysis of a membrane protein. Annu Rev Genet. 1990;24:133-170. doi 10.1146/annurev.ge.24.120190.001025

16. Holla Ø.L., Nakken S., Mattingsdal M., Ranheim T., Berge K.E., Defesche J.C., Leren T.P. Effects of intronic mutations in the LDLR gene on pre-mRNA splicing: comparison of wet-lab and bioinformatics analyses. Mol Genet Metab. 2009;96(4):245-252. doi 10.1016/j.ymgme.2008.12.014

17. Hu P., Dharmayat K.I., Stevens C.A.T., Sharabiani M.T.A., Jones R.S., Watts G.F., Genest J., Ray K.K., Vallejo-Vaz A.J. Prevalence of familial hypercholesterolemia among the general population and patients with atherosclerotic cardiovascular disease: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 2020;141(22):1742-1759. doi 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.044795

18. Jenkins J.L., Agrawal A.A., Gupta A., Green M.R., Kielkopf C.L. U2AF65 adapts to diverse pre-mRNA splice sites through conformational selection of specific and promiscuous RNA recognition motifs. Nucleic Acids Res. 2013;41(6):3859-3873. doi 10.1093/nar/gkt046

19. Kulseth M.A., Berge K.E., Bogsrud M.P., Leren T.P. Analysis of LDLR mRNA in patients with familial hypercholesterolemia revealed a novel mutation in intron 14, which activates a cryptic splice site. J Hum Genet. 2010;55(10):676-680. doi 10.1038/jhg.2010.87

20. Liguori R., Bianco A.M., Argiriou A., Pauciullo P., Giannino A., Rubba P., De Simone V. LDL receptor cDNA sequence analysis in familial hypercholesterolemia patients: 5 novel mutations with high prevalence in families originating from southern Italy. Hum Mutat. 2001;17(5):433. doi 10.1002/humu.1122

21. Malard F., Mackereth C.D., Campagne S. Principles and correction of 5′-splice site selection. RNA Biol. 2022;19(1):943-960. doi 10.1080/15476286.2022.2100971

22. Marduel M., Carrié A., Sassolas A., Devillers M., Carreau V., Di Filippo M., Erlich D., … Junien C.; French ADH Research Network; Boileau C., Varret M., Rabès J.P. Molecular spectrum of autosomal dominant hypercholesterolemia in France. Hum Mutat. 2010;31(11): E1811-E1824. doi 10.1002/humu.21348

23. Martín-Campos J.M., Plana N., Figueras R., Ibarretxe D., Caixàs A., Esteve E., Pérez A., … Pintó X., Masana L., Julve J., Blanco-Vaca F.; Xarxa d’Unitats de Lípids i Arteriosclerosi (XULA). Autosomal dominant hypercholesterolemia in Catalonia: correspondence between clinical-biochemical and genetic diagnostics in 967 patients studied in a multicenter clinical setting. J Clin Lipidol. 2018;12(6):14521462. doi 10.1016/j.jacl.2018.09.002

24. Meshkov A., Ershova A., Kiseleva A., Zotova E., Sotnikova E., Petukhova A., Zharikova A., … Makarov V., Kukharchuk V., Boytsov S., Yudin S., Drapkina O. The LDLR, APOB, and PCSK9 variants of index patients with familial hypercholesterolemia in Russia. Genes (Basel). 2021;12(1):66. doi 10.3390/genes12010066

25. Miroshnikova V.V., Romanova O.V., Ivanova O.N., Fedyakov M.A., Panteleeva A.A., Barbitoff Y.A., Muzalevskaya M.V., … Guseva D.M., Pchelina S.N., Glotov A.S., Zakharova E.Y., Glotov O.S. Identification of novel variants in the LDLR gene in Russian patients with familial hypercholesterolemia using targeted sequencing. Biomed Rep. 2021;14(1):15. doi 10.3892/br.2020.1391

26. Nazarenko M.S., Sleptcov A.A., Zarubin A.A., Salakhov R.R., Shevchenko A.I., Tmoyan N.A., Elisaphenko E.A., Zubkova E.S., Zheltysheva N.V., Ezhov M.V., Kukharchuk V.V., Parfyonova Yu.V., Zakian S.M., Zakharova I.S. Calling and phasing of single-nucleotide and structural variants of the LDLR gene using Oxford Nanopore MinION. Int J Mol Sci. 2023;24(5):4471. doi 10.3390/ijms 24054471

27. Nordestgaard B.G., Chapman M.J., Humphries S.E., Ginsberg H.N., Masana L., Descamps O.S., Wiklund O., … Stalenhoef A.F., Stroes E., Taskinen M.R., Tybjærg-Hansen A.; European Atherosclerosis Society Consensus Panel. Familial hypercholesterolaemia is underdiagnosed and undertreated in the general population: guidance for clinicians to prevent coronary heart disease: consensus statement of the European Atherosclerosis Society. Eur Heart J. 2013;34(45):3478-3490. doi 10.1093/eurheartj/eht273

28. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012;28(8):1166-1167. doi 10.1093/bioinformatics/bts091

29. Reeskamp L.F., Hartgers M.L., Peter J., Dallinga-Thie G.M., Zuurbier L., Defesche J.C., Grefhorst A., Hovingh G.K. A deep intronic variant in LDLR in familial hypercholesterolemia. Circ Genom Precis Med. 2018;11(12):e002385. doi 10.1161/CIRCGEN.118.002385

30. Reeskamp L.F., Balvers M., Peter J., van de Kerkhof L., Klaaijsen L.N., Motazacker M.M., Grefhorst A., van Riel N.A.W., Hovingh G.K., Defesche J.C., Zuurbier L. Intronic variant screening with targeted next-generation sequencing reveals first pseudoexon in LDLR in familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis. 2021;321:14-20. doi 10.1016/j.atherosclerosis.2021.02.003

31. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W.W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K., Rehm H.L. Standards and guidelines for the interpretation of sequence va riants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424. doi 10.1038/gim.2015.30

32. Rieck L., Bardey F., Grenkowitz T., Bertram L., Helmuth J., Mischung C., Spranger J., Steinhagen-Thiessen E., Bobbert T., Kassner U., Demuth I. Mutation spectrum and polygenic score in German patients with familial hypercholesterolemia. Clin Genet. 2020; 98(5):457-467. doi 10.1111/cge.13826

33. Sambrook J., Russell D.W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006;2006(1):pdb.prot4455. doi 10.1101/pdb.prot4455

34. Segrest J.P., Jones M.K., De Loof H., Dashti N. Structure of apolipoprotein B-100 in low density lipoproteins. J Lipid Res. 2001;42(9): 1346-1367. doi 10.1016/S0022-2275(20)30267-4

35. Semenova A.E., Sergienko I.V., García-Giustiniani D., Monserrat L., Popova A.B., Nozadze D.N., Ezhov M.V. Verification of underlying genetic cause in a cohort of Russian patients with familial hypercholesterolemia using targeted next generation sequencing. J Cardiovasc Dev Dis. 2020;7(2):16. doi 10.3390/jcdd7020016

36. Shakhtshneider E.V., Ivanoshchuk D.E., Makarenkova K.V., Orlov P.S., Timoshchenko O.V., Bazhan S.S., Nikitin Yu.P., Voev o da M.I. Cascade genetic screening in diagnostics of heterozygous familial hypercholesterolemia: clinical case. Rossijskii Kardiologicheskii Zhur nal = Russian Journal of Cardiology. 2017;22(6):178-179. doi 10.15829/1560-4071-2017-6-178-179 (in Russian)

37. Shamsani J., Kazakoff S.H., Armean I.M., McLaren W., Parsons M.T., Thompson B.A., O’Mara T.A., Hunt S.E., Waddell N., Spurdle A.B. A plugin for the Ensembl Variant Effect Predictor that uses MaxEntScan to predict variant spliceogenicity. Bioinformatics. 2019;35(13):2315-2317. doi 10.1093/bioinformatics/bty960

38. Südhof T.C., Goldstein J.L., Brown M.S., Russell D.W. The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins. Science. 1985;228(4701):815-822. doi 10.1126/science.2988123

39. Voith von Voithenberg L., Sánchez-Rico C., Kang H.S., Madl T., Zanier K., Barth A., Warner L.R., Sattler M., Lamb D.C. Recognition of the 3′ splice site RNA by the U2AF heterodimer involves a dynamic population shift. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(46):E7169E7175. doi 10.1073/pnas.1605873113

40. Vorechovský I. Aberrant 3′ splice sites in human disease genes: mutation pattern, nucleotide structure and comparison of computational tools that predict their utilization. Nucleic Acids Res. 2006;34(16): 4630-4641. doi 10.1093/nar/gkl535

41. Walker L.C., de la Hoya M., Wiggins G.A.R., Lindy A., Vincent L.M., Parsons M.T., Canson D.M., … Pesaran T., Karam R., Harrison S.M., Spurdle A.B.; ClinGen Sequence Variant Interpretation Working Group. Using the ACMG/AMP framework to capture evidence related to predicted and observed impact on splicing: recommendations from the ClinGen SVI Splicing Subgroup. Am J Hum Genet. 2023;110(7):1046-1067. doi 10.1016/j.ajhg.2023.06.002