Особенности экспериментального планирования при исследовании транскриптомов методами высокопроизводительного секвенирования

В обзоре проанализированы отдельные проблемы планирования экспериментов с использованием методов RNA-Seq и Ribo-Seq, а также консолидированы ранее опубликованные рекомендации консорциума ENCODE (2011) и других авторов по вопросам планирования экспериментов при изучении транскриптомов как у млекопитающих, так и у других животных и растений. Существует предел увеличения глубины секвенирования для идентификации практически всех активно транскрибируемых в образце генов, который зависит от размера транскриптома у объекта исследования. Увеличение глубины прочтения транскриптома выше рекомендуемой не даст значительного повышения статистической мощности исследования. У млекопитающих для идентификации активно транскрибируемых генов оптимальная глубина секвенирования составляет ~2 × 109 п. н. на биологический образец. Для остальных видов глубина секвенирования на образец определяется с учетом данного значения, но должна быть пересчитана относительно протяженности транскриптома и удельного количества РНК на клетку в сравнении с транскриптомом млекопитающих. Выявление дифференциально экспрессируемых генов и стыков сайтов сплайсинга в мРНК можно улучшить, повышая число анализируемых биологических образцов в экспериментальных группах. Минимально допустимое число биологических повторов в группе должно быть равно двум. В то же время оптимальное число биологических повторов при соблюдении вышеозначенной глубины секвенирования составляет 5–8 образцов (как и при количественной оценке экспрессии отдельных генов методом qRT-PCR). При выполнении определения последовательности транскриптов рекомендуется использовать технологии секвенирования, точность определения буквы последовательности для которых ≥ 0,999. Учитывая удельную себестоимость секвенирования, для метода RNA-Seq целесообразно использовать технологии, дающие риды длиной ≥ 75 п. н. Удельные затраты на секвенирование в контрольных группах можно снизить за счет увеличения числа опытных экспериментальных групп путем компоновки нескольких сходных экспериментов или логического усложнения исходного эксперимента. Данные рекомендации могут быть использованы для планирования экспериментов по изучению транксриптомов в функциональной геномике.

1. Ansorge W.J. Next-generation DNA sequencing techniques. Nаt. Biotechnol. 2009;25(4):195-203. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2008.12.009

2. Arner E., Beckhouse A., Briggs J., Ovchinnikov D., Wolvetang E., Wells C. and FANTOM Consortium. Transcribed enhancers lead waves of coordinated transcription in transitioning mammalian cells. Science. 2015;347(6225):1010-1014. https://doi.org/10.1126/science.1259418

3. Aspden J.L., Eyre-Walker Y.C., Phillips R.J., Amin U., Mumtaz M.A., Brocard M., Couso J.P. Extensive translation of small open reading frames revealed by Poly-Ribo-Seq. Elife. 2014; 3:e03528. https://doi.org/10.7554/eLife.03528

4. Bennett N.C., Farah C.S. Next-generation sequencing in clinical oncology: Next Steps Towards Clinical Validation. Cancers (Basel). 2014;6(4):2296-2312. https://doi.org/10.3390/cancers6042296

5. Ching T., Huang S., Garmire L.X. Power analysis and sample size estimation for RNA-Seq differential expression. RNA. 2014;20(11):1684-1696. https://doi.org/10.1261/rna.046011.114

6. Coate J.E., Doyle J.J. Quantifying whole transcriptome size, a prerequisite for understanding transcriptome evolution across species: an example from a plant allopolyploid. Genome Biol. Evol. 2010;2:534-546. https://doi.org/10.1093/gbe/evq038

7. Coate J.E., Doyle J.J. Variation in transcriptome size: are we getting the message? Chromosoma. 2015;124(1):27-43. https://doi.org/10.1007/s00412-014-0496-3

8. Corney D.C. RNA-seq using next generation sequencing. Mater. Methods. 2013;3:203. https://doi.org/10.13070/mm.en.3.203

9. Florea L.D., Salzberg S.L. Genome-guided transcriptome assembly in the age of next-generation sequencing. IEEE/ACM Trans. Comput. Biol. Bioinform. 2013;10(5):1234-1240.

10. Flusser G., Ginzburg V., Meyuhas O. Glucocorticoids induce transcription of ribosomal protein genes in rat liver. Mol. Cell. Endocrinol. 1989;64(2):213-222. https://doi.org/10.1016/0303- 7207(89)90148-2

11. Fox E.J., Reid-Bayliss K.S., Emond M.J., Loeb L.A. Accuracy of next generation sequencing platforms. Next Gener. Seq. Appl. 2014;1:1000106. https://doi.org/10.4172/jngsa.1000106

12. Galau G.A., Klein W.H., Britten R.J., Davidson E.H. Significance of rare mRNA sequences in liver. Arch. Biochem. Biophys. 1977;179(2):584-599. https://doi.org/10.1016/0003-9861(77)90147-3

13. Gargis A.S., Kalman L., Bick D.P., da Silva C., Dimmock D.P., Funke B.H., Gowrisankar S., Hegde M.R., Kulkarni S., Mason C.E., Nagarajan R., Voelkerding K.V., Worthey E.A., Aziz N., Barnes J., Bennett S.F., Bisht H., Church D.M., Dimitrova Z., Gargis S.R., Hafez N., Hambuch T., Hyland F.C., Luna R.A., MacCannell D., Mann T., McCluskey M.R., McDaniel T.K., Ganova-Raeva L.M., Rehm H.L., Reid J., Campo D.S., Resnick R.B., Ridge P.G., Salit M.L., Skums P., Wong L.J., Zehnbauer B.A., Zook J.M., Lubin I.M. Good laboratory practice for clinical next-generation sequencing informatics pipelines. Nat. Biotechnol. 2015;33(7):689-693. https://doi.org/10.1038/nbt.3237

14. Ghosh S., Chan C.K. Analysis of RNA-Seq Data using TopHat and Cufflinks. Method. Mol. Biol. 2016;1374:339-361. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3167-5_18

15. Hart T., Komori H.K., LaMere S., Podshivalova K., Salomon D.R. Finding the active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 2013;14:778. https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-778

16. Hart S.N., Therneau T.M., Zhang Y., Poland G.A., Kocher J.P. Calculating sample size estimates for RNA sequencing data. J. Comput. Biol. 2013;20(12):970-978. https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0283

17. Hawrylycz M.J., Lein E.S., Guillozet-Bongaarts A.L., Shen E.H., Ng L., Miller J.A., van de Lagemaat L.N., Smith K.A., Ebbert A., Riley Z.L., Abajian C., Beckmann C.F., Bernard A., Bertagnolli D., Boe A.F., Cartagena P.M., Chakravarty M.M., Chapin M., Chong J., Dalley R.A., Daly B.D., Dang C., Datta S., Dee N., Dolbeare T.A., Faber V., Feng D., Fowler D.R., Goldy J., Gregor B.W., Haradon Z., Haynor D.R., Hohmann J.G., Horvath S., Howard R.E., Jeromin A., Jochim J.M., Kinnunen M., Lau C., Lazarz E.T., Lee C., Lemon T.A., Li L., Li Y., Morris J.A., Overly C.C., Parker P.D., Parry S.E., Reding M., Royall J.J., Schulkin J., Sequeira P.A., Slaughterbeck C.R., Smith S.C., Sodt A.J., Sunkin S.M., Swanson B.E., Vawter M.P., Williams D., Wohnoutka P., Zielke H.R., Geschwind D.H., Hof P.R., Smith S.M., Koch C., Grant S.G., Jones A.R. An anatomically comprehensive atlas of the adult human brain transcriptome. Nature. 2012;489(7416):391-399. https://doi.org/10.1038/nature11405

18. Hebenstreit D., Fang M., Gu M., Charoensawan V., van Oudenaarden A., Teichmann S.A. RNA sequencing reveals two major classes of gene expression levels in metazoan cells. Mol. Syst. Biol. 2011;7: 497. https://doi.org/10.1038/msb.2011.28

19. Hughes M.E., Grant G.R., Paquin C., Qian J., Nitabach M.N. Deep sequencing the circadian and diurnal transcriptome of Drosophila brain. Genome Res. 2012;22(7):1266-1281. https://doi.org/10.1101/gr.128876.111

20. Ingolia N.T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat. Rev. Genet. 2014;15(3):205-213. https://doi.org/10.1038/nrg3645

21. Kagale S., Koh C., Nixon J., Bollina V., Clarke W.E., Tuteja R., Spillane C., Robinson S.J., Links M.G., Clarke C., Higgins E.E., Huebert T., Sharpe A.G., Parkin I.A. The emerging biofuel crop Camelina sativa retains a highly undifferentiated hexaploid genome structure. Nat. Commun. 2014;5:3706. https://doi.org/10.1038/ncomms4706

22. Karlen Y., McNair A., Perseguers S., Mazza C., Mermod N. Statistical significance of quantitative PCR. BMC Bioinformatics. 2007;8:131. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-131

23. Kellis M., Wold B., Snyder M.P., Bernstein B.E., Kundaje A., Marinov G.K., Ward L.D., Birney E., Crawford G.E., Dekker J., Dunham I., Elnitski L.L., Farnham P.J., Feingold E.A., Gerstein M., Giddings M.C., Gilbert D.M., Gingeras T.R., Green E.D., Guigo R., Hubbard T., Kent J., Lieb J.D., Myers R.M., Pazin M.J., Ren B., Stamatoyannopoulos J.A., Weng Z., White K.P., Hardison R.C. Defining functional DNA elements in the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014;111(17):6131-6138. https://doi.org/10.1073/pnas.1318948111

24. Kozhevnikova O.S., Korbolina E.E., Ershov N.I., Kolosova N.G. Rat retinal transcriptome: effects of aging and AMD-like retinopathy. Cell Cycle. 2013;12(11):1745-1761. https://doi.org/10.4161/cc.24825

25. Krasileva K.V., Buffalo V., Bailey P., Pearce S., Ayling S., Tabbita F., Soria M., Wang S., IWGS Consortium, Akhunov E., Uauy C., Dubcovsky J. Separating homeologs by phasing in the tetraploid wheat transcriptome. Genome Biol. 2013;14(6):R66. https://doi.org/10.1186/gb-2013- 14-6-r66

26. Liu Y., Zhou J., White K.P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication? Bioinformatics. 2014;30(3): 301-304. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt688

27. Mardis E.R. The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends Genet. 2008;24(3):133-141. https://doi.org/10.1016/j.tig.2007. 12.007

28. Marguerat S., Bähler J. Coordinating genome expression with cell size. Trends Genet. 2012;28(11):560-565. https://doi.org/10.1016/j.tig.2012.07.003

29. Marinov G.K., Williams B.A., McCue K., Schroth G.P., Gertz J., Myers R.M., Wold B.J. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 2014;24(3):496-510. https://doi.org/10.1101/gr.161034.113

30. Martin J.A., Wang Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 2011;12(10):671-682. https://doi.org/10.1038/nrg3068

31. McManus C.J., Coolon J.D., Duff M.O., Eipper-Mains J., Graveley B.R., Wittkopp P.J. Regulatory divergence in Drosophila revealed by mRNA-seq. Genome Res. 2010;20(6):816-825. https://doi.org/10.1101gr. 102491.109

32. Menshanov P.N., Dygalo N.N. Methodological aspects of read mapping and assembly of transcriptomes derived from the brain tissue samples of Rattus norvegicus. Rus. J. Genet: Appl. Res. 2015;5(4):401-406. https://doi.org/10.1134/S2079059715040097

33. Mortazavi A., Williams B.A., McCue K., Schaeffer L., Wold B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 2008;5(7):621-628. https://doi.org/10.1038/nmeth.1226

34. Moskalev A., Zhikrivetskaya S., Krasnov G., Shaposhnikov M., Proshkina E., Borisoglebsky D., Danilov A., Peregudova D., Sharapova I., Dobrovolskaya E., Solovev I., Zemskaya N., Shilova L., Snezhkina A., Kudryavtseva A. A comparison of the transcriptome of Drosophila melanogaster in response to entomopathogenic fungus, ionizing radiation, starvation and cold shock. BMC Genomics. 2015;16(Suppl. 13):S8. https://doi.org/10.1186/1471-2164-16-S13-S8

35. Mutz K.O., Heilkenbrinker A., Lönne M., Walter J.G., Stahl F. Transcriptome analysis using next-generation sequencing. Curr. Opin. Biotechnol. 2013;24(1):22-30. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2012.09.004

36. Nfonsam L.E., Cano C., Mudge J., Schilkey F.D., Curtiss J. Analysis of the transcriptomes downstream of Eyeless and the Hedgehog, Decapentaplegic and Notch signaling pathways in Drosophila melanogaster. PLoS One. 2012;7(8):e44583. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0044583

37. Nonis A., De Nardi B., Nonis A. Choosing between RT-qPCR and RNA-seq: a back-of-the-envelope estimate towards the definition of the break-even-point. Anal. Bioanal. Chem. 2014;406(15):3533-3536. https://doi.org/10.1007/s00216-014-7687-x

38. O’Rourke J.A., Iniguez L.P., Fu F., Bucciarelli B., Miller S.S., Jackson S.A., McClean P.E., Li J., Dai X., Zhao P.X., Hernandez G., Vance C.P. An RNA-Seq based gene expression atlas of the common bean. BMC Genomics. 2014;15:866. https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-866

39. Pembroke W.G., Babbs A., Davies K., Ponting C.P., Oliver P.L. Temporal transcriptomics suggest that twin-peaking genes reset the clock. Elife. 2015;4.pii:e10518. https://doi.org/10.7554/eLife.10518

40. Reef R., Ball M.C., Feller I.C., Lovelock C.E. Relationships among RNA:DNA ratio, growth and elemental stoichiometry in mangrove trees. Funct. Ecol. 2010;24(5):1064-1072. https://doi.org/10.1111/j.1365-2435. 2010.01722.x

41. Schmidt E.E., Schibler U. Cell size regulation, a mechanism that controls cellular RNA accumulation: consequences on regulation of the ubiquitous transcription factors Oct1 and NF-Y and the liver-enriched transcription factor DBP. J. Cell Biol. 1995;128(4):467-483.

42. Shishkina G.T., Kalinina T.S., Bulygina V.V., Lanshakov D.A., Babluk E.V., Dygalo N.N. Anti-apoptotic protein Bcl-xL expression in the midbrain raphe region Is sensitive to stress and glucocorticoids. PLoS One. 2015;10(12):e0143978. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0143978

43. Sims D., Sudbery I., Ilott N.E., Heger A., Ponting C.P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat. Rev. Genet. 2014;15(2):121-132. https://doi.org/10.1038/nrg3642

44. Spies D., Ciaudo C. Dynamics in transcriptomics: advancements in RNA-seq time course and downstream analysis. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2015;13:469-477. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2015.08.004

45. Tarazona S., García-Alcalde F., Dopazo J., Ferrer A., Conesa A. Differential expression in RNA-seq: a matter of depth. Genome Res. 2011;21(12):2213-2223. https://doi.org/10.1101/gr.124321.111

46. The ENCODE Consortium. Standards, Guidelines and Best Practices for RNA-Seq V1.0. 1.0. 6-1-2011.

47. Thompson W.L., Abeles F.B., Beall F.A., Dinterman R.E., Wannemacher R.W. Jr. Influence of the adrenal glucocorticoids on the stimulation of synthesis of hepatic ribonucleic acid and plasma acute-phase globulins by leucocytic endogenous mediator. Biochem. J. 1976; 156(1):25-32.

48. van Bakel H., Nislow C., Blencowe B.J., Hughes T.R. Response to “The reality of pervasive transcription”. PLoS Biol. 2011;9(7):e1001102. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001102

49. Veeneman B.A., Shukla S., Dhanasekaran S.M., Chinnaiyan A.M., Nesvizhskii A.I. Two-pass alignment improves novel splice junction quantification. Bioinformatics. 2015;32:43-49. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv642

50. Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 2009;10(1):57-63. https://doi.org/10.1038/nrg2484

51. Wetterstrand K. DNA sequencing costs: data from the NHGRI largescale genome sequencing program. (2015). Available at http://www.genome.gov/sequencingcosts

52. Xie C., Yuan J., Li H., Li M., Zhao G., Bu D., Zhu W., Wu W., Chen R., Zhao Y. NONCODEv4: exploring the world of long non-coding RNA genes. Nucleic Acids Res. 2014;42(Database issue):D98-D103. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1222

53. Zimmerman E.F., Andrew F., Kalter H. Glucocorticoid inhibition of RNA synthesis responsible for cleft palate in mice: a model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1970;67(2):779-785.