Определение числа копий эндогенных ретровирусов типа А у домашних свиней и диких кабанов

Современная трансплантология испытывает острейший недоста-ток в донорских органах. Для решения проблемы был предложен подход, основанный на использовании органов и тканей животных для пересадки человеку (ксенотрансплантация). Однако широкому развитию этого направления препятствует риск передачи человеку зоонозных инфекционных заболеваний. По эконо-мическим и этическим критериям, а также благодаря сходству по анатомическим и физиологическим параметрам, свинья является наиболее оптимальным источником органов для ксенотрансплантации. В геноме свиньи содержатся эндогенные ретровирусы (PERV) типа А которые могут инфицировать клеточные линии человека in vitro. Специально для биомедицинских целей, в том числе ксенотрансплантации, в Институте цитологии и генетики СО РАН была выведена селекционная группа сибирских миниатюрных свиней. Цель работы заключалась в анализе числа копий PERV A у сибирских миниатюрных свиней, пород-основателей ландрас и крупная белая, а также диких кабанов. Число копий PERV определяли методом абсолютного количественного анализа с использованием красителя SYBR Green. В качестве стандарта использовали образец с известным числом копий, который получали методом конечных разведений. Число копий PERV А в калибровочных образцах ДНК сибирских миниатюрных свиней составило 2.4, 3.6 и 4.9 копии PERV А на клетку, что хорошо совпадает с данными других авторов. Медиана числа копий PERV A на клетку составила 4.5 у сибирских миниатюрных свиней, 1.3 у ландрасов, 1.0 у представителей крупной белой породы и 0.8 у диких кабанов. Достоверные различия в числе копий ретровируса обнаружены между миниатюрными свиньями и дикими кабанами. Таким образом, геном сибирских миниатюрных свиней содержит значительное число копий потенциально патогенных для человека ретровирусов PERV типа А. Для ксенотрансплантации необходимо отбирать животных с наименьшим числом ретровирусов в геноме. Метод количественного определения числа копий PERV А с исполь-зованием красителя SYBR Green позволяет выявить таких животных и проводить селекцию сибирских миниатюрных свиней на уменьшение этого показателя.

1. Aitnazarov R.B., Nikitin S.V., Knyazev S.P., Yudin N.S. The saturation of genome of the pig by porcine endogenous retroviruses: the influence of heredity and environment. Innovatsii i prodovolstvennaya bezopasnost = Innovations and food security. 2014;2:41-49. (in Russian)

2. Aitnazarov R.B., Yudin N.S., Nikitin S.V., Ermolayev V.I., Voevoda M.I. Identification of whole genomes of endogenous retroviruses in Siberian miniature pigs. Rus. J. Genetics: Applied Research. 2014;4(6):523-525. DOI 10.1134/S2079059714060021.

3. Akiyoshi D.E., Denaro M., Zhu H., Greenstein J.L., Banerjee P., Fishman J.A. Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine. J. Virology. 1998;72(5):4503-4507.

4. Bosch S., Arnauld C., Jestin A. Study of full-length porcine endogenous retrovirus genomes with envelope gene polymorphism in a specificpathogen- free Large White swine herd. J. Virology. 2000;74(18): 8575-8581.

5. Denner J. Recombinant porcine endogenous retroviruses (PERV-A/C): a new risk for xenotransplantation? Archives Virology. 2008;153(8): 1421-1426. DOI 10.1007/s00705-008- 0141-7.

6. Denner J. How active are porcine endogenous retroviruses (PERVs)? Viruses. 2016;8(8):E215. DOI 10.3390/v8080215.

7. Ekser B., Cooper D.K., Tector A.J. The need for xenotransplantation as a source of organs and cells for clinical transplantation. Intern. J. Surgery. 2015;23:199-204. DOI 10.1016/j.ijsu.2015.06.066.

8. Frühauf J.H., Mertsching H., Giri S., Frühauf N.R., Bader A. Porcine endogenous retrovirus released by a bioartificial liver infects primary human cells. Liver International. 2009;29(10):1553-1561. DOI 10.1111/j.1478-3231.2009.02087.x.

9. Godehardt A.W., Rodrigues Costa M., Tönjes R.R. Review on porcine endogenous retrovirus detection assays–impact on quality and safety of xenotransplants. Xenotransplantation. 2015;22(2):95-101. DOI 10.1111/xen.12154.

10. Herring C., Quinn G., Bower R., Parsons N., Logan N.A., Brawley A., Elsome K., Whittam A., Fernandez-Suarez X.M., Cunningham D., Onions D., Langford G., Scobie L. Mapping full- length porcine endogenous retroviruses in a large white pig. J. Virology. 2001;75(24): 12252-12265.

11. Karlas A., Irgang M., Votteler J., Specke V., Ozel M., Kurth R., Denner J. Characterisation of a human cell-adapted porcine endogenous retrovirus PERV-A/C. Ann. Transplantation. 2010;15(2):45-54.

12. Kimsa M.C., Strzalka-Mrozik B., Kimsa M.W., Gola J., Nicholson P., Lopata K., Mazurek U. Porcine endogenous retroviruses in xenotransplantation – molecular aspects. Viruses. 2014;6(5):2062-2083. DOI 10.3390/v6052062.

13. Le Tissier P., Stoye J.P., Takeuchi Y., Patience C., Weiss R.A. Two sets of human-tropic pig retrovirus. Nature. 1997;389(6652):681-682.

14. Lee D., Kim N.Y., Bae G.E., Lee H.J., Kwon M., Kim S.S., Lee H.T., Yang J.M., Kim Y.B. Transmissible infection of human 293T cells with porcine endogenous retroviruses subgroup А from NIH-miniature pig. Transplantation Proceed. 2008;40(10):3742-3745. DOI 10.1016/j.transproceed.2008.09.035.

15. Lee D., Lee J., Yoon J.K., Kim N.Y., Kim G.W., Park C., Oh Y.K., Kim Y.B. Rapid determination of PERV copy number from porcine genomic DNA by real-time polymerase chain reaction. Animal Biotechnol. 2011;22(4):175-180. DOI 10.1080/10495398.2011.595294.

16. Li Z., Ping Y., Shengfu L., Yangzhi Z., Jingqiu C., Youping L., Hong B. Variation of host cell tropism of porcine endogenous retroviruses expressed in chinese Banna minipig inbred. Intervirology. 2006;49(4): 185-191.

17. Liu G., Li Z., Pan M., Ge M., Wang Y., Gao Y. Genetic prevalence of porcine endogenous retrovirus in chinese experimental miniature pigs. Transplantation Proceed. 2011;43(7):2762-2769. DOI 10.1016/j.transproceed.2011.06.061.

18. Ma Y., Yang Y., Lv M., Yan Q., Zheng L., Ding F., Wu J., Tian K., Zhang J. Real-time quantitative polymerase chain reaction with SYBR green I detection for estimating copy numbers of porcine endogenous retrovirus from Chinese miniature pigs. Transplantation Proceed. 2010;42(5):1949-1952. DOI 10.1016/j.transproceed. 2010.01.054.

19. Mang R., Maas J., Chen X., Goudsmit J., van der Kuyl A.C. Identification of a novel type C porcine endogenous retrovirus: evidence that copy number of endogenous retroviruses increases during host inbreeding. J. General Virology. 2001;82(Pt. 8):1829-1834.

20. Marcucci K.T., Argaw T., Wilson C.A., Salomon D.R. Identification of two distinct structural regions in a human porcine endogenous retrovirus receptor, HuPAR2, contributing to function for viral entry. Retrovirology. 2009;6(3):1-15. DOI 10.1186/1742-4690-6-3.

21. Mazurek U., Kimsa M.C., Strzalka-Mrozik B., Kimsa M.W., Adamska J., Lipinski D., Zeyland J., Szalata M., Slomski R., Jura J., Smorag Z., Nowak R., Gola J. Quantitative analysis of porcine endogenous retroviruses in different organs of transgenic pigs generated for xenotransplantation. Current Microbiology. 2013;67(4):505-514. DOI 10.1007/s00284-013- 0397-3.

22. Morozov V.A., Morozov A.V., Rotem A., Barkai U., Bornstein S., Denner J. Extended microbiological characterization of Göttingen minipigs in the context of xenotransplantation: detection and vertical transmission of hepatitis E virus. PLoS One. 2015;10(10):e0139893. DOI 10.1371/journal.pone.0139893.

23. Nakaya Y., Shojima T., Yasuda J., Imakawa K., Miyazawa T. Epigenetic regulation on the 5’- proximal CpG island of human porcine endogenous retrovirus subgroup A receptor 2/GPR172B. Microbes Infect. 2011;13(1):49-57. DOI 10.1016/j.micinf.2010.09.014.

24. Niebert M., Tonjes R.R. Evolutionary spread and recombination of porcine endogenous retroviruses in suiformes. J. Virology. 2005;79(1): 649-654.

25. Nikitin S.V., Yudin N.S., Knyazev S.P., Aitnazarov R.B., Kobzev V.F., Bekenev V.A., Savvina M.A., Ermolaev V.I. Frequency of chromosomes carrying endogenous retroviruses in the populations of domestic pig and wild boar. Genetika = Genetics (Moscow). 2008;44(6):789- 797. (in Russian)

26. Quereda J.J., Herrero-Medrano J.M., Abellaneda J.M., García-Nicolás O., Martínez-Alarcón L., Pallarés F.J., Ramírez P., Muñoz A., Ramis G. Porcine endogenous retrovirus copy number in different pig breeds is not related to genetic diversity. Zoonoses Public Health. 2012; 59(6):401-407. DOI 10.1111/j.1863-2378.2012.01467.x.

27. Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Y., Semenov P.A., Savilova A.M., Kofiadi I.A., Abramov D.D. PTsR «v real’nom vremeni» [Real- time PCR]. Moscow, BINOM. Laboratoriya znaniy Publ., 2009. (in Russian)

28. Sedlak R.H., Jerome K.R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology Infectious Disease. 2013;75(1):1-4. DOI 10.1016/j.diagmicrobio.2012.10.009.

29. Shimatsu Y., Yamada K., Horii W., Hirakata A., Sakamoto Y., Waki S., Sano J., Saitoh T., Sahara H., Shimizu A., Yazawa H., Sachs D.H., Nunoya T. Production of cloned NIBS (Nippon Institute for Biological Science) and α-1, 3-galactosyltransferase knockout MGH miniature pigs by somatic cell nuclear transfer using the NIBS breed as surrogates. Xenotransplantation. 2013;20(3):157-164. DOI 10.1111/xen.12031.

30. Specke V., Rubant S., Denner J. Productive infection of human primary cells and cell lines with porcine endogenous retroviruses. Virology. 2001;285(2):177-180.

31. Tikhonov V.N. Laboratornye mini-svin’i, genetika i mediko-biologicheskoe ispolzovanie [Laboratory Mini-pigs: Genetics and Biomedical Use]. Novosibirsk, SB RAS Publ., 2010. (in Russian)

32. Yang L., Güell M., Niu D., George H., Lesha E., Grishin D., Aach J., Shrock E., Xu W., Poci J., Cortazio R., Wilkinson R.A., Fishman J.A., Church G. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science. 2015;350(6264):1101-1104. DOI 10.1126/science.aad1191.

33. Yu P., Zhang L., Li S.F., Cheng J.Q., Lu Y.R., Zeng Y.Z., Li Y.P., Bu H. A rapid method for detection of the copy number of porcine endogenous in swine. J. Rapid Methods Automation Microbiology. 2007; 15:199-205.

34. Yu P., Zhang P., Zhang L., Li S.F., Cheng J.Q., Lu Y.R., Li Y.P., Bu H. Studies on long-term infection of human cells with porcine endogenous retrovirus. Acta Virologica. 2009;53(3):169-174.

35. Yudin N.S., Aitnazarov R.B., Ermolaev V.I. Porcine endogenous retroviruses: what are the risks of infection transmission in xenotransplantation? Rus. J. Genet. Appl. Res. 2011;1(6):532-539. DOI 10.1134/S207905971106013X.

36. Zhang P., Yu P., Wang W., Zhang L., Li S., Bu H. An effective method for the quantitative detection of porcine endogenous retrovirus in pig tissues. In Vitro Cellular & Develop. Biology – Animal. 2010; 46(5):408-410. DOI 10.1007/s11626-009-9264-8.