Практическое руководство по редактированию геномов системой CRISPR/Cas9

Технология CRISPR/Cas за последние несколько лет совершила прорыв в области редактирования геномов. В силу высокой эффективности и простоты сборки отдельных компонент в условиях современной лаборатории, система CRISPR/Cas применяется огромным количеством исследователей в самых разных областях биологии. После появления первых сведений о редактировании генома млекопитающих системой CRISPR/Cas9 было разработано множество методов, предлагающих те или иные модификации белков семейства Cas или направляющих РНК. Целый ряд работ посвящен использованию технологий, основанных на системе CRISPR/Cas, для самых неожиданных целей – не только для редактирования геномов, но и для контроля экспрессии определенных генов, локализации и визуализации отдельных локусов ДНК в пространстве ядра, изменения статуса метилирования заданных сайтов в геноме млекопитающих и многое другое. Подробности работы системы CRISPR/Cas и способы ее применения детально рассмотрены нами ранее. Наиболее часто система CRISPR/ Cas используется именно для редактирования 
геномов, однако, несмотря на кажущуюся простоту, существует ряд технических сложностей, с которыми можно столкнуться, применяя эту технологию впервые. В настоящей статье подробно описаны протоколы, связанные со сборкой, тестированием и использованием системы CRISPR/Cas9 для внесения мутаций в геном млекопитающих. Дано краткое пояснение теоретических аспектов процессов, связанных с внесением направленных модификаций в геном млекопитающих. Подробно описана методика клонирования и тестирования векторов для доставки компонент системы CRISPR/Cas9 в клетки. Приведены протоколы модификации генома клеток в культуре и создания трансгенных животных. В каждом из разделов упомянуты потенциальные сложности, связанные с использованием системы CRISPR/Cas9, и предложены способы их преодоления.

1. Bindra R.S., Goglia A.G., Jasin M., Powell S.N. Development of an assay to measure mutagenic non-homologous end-joining repair activity in mammalian cells. Nucl. Acids Res. 2013;41(11):e115-e115. DOI 10.1093/nar/gkt255.

2. Brinster R.L., Chen H.Y., Trumbauer M.E., Yagle M.K., Palmiter R.D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985;82(13): 4438-4442.

3. Bryja V., Bonilla S., Arenas E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat. Protoc. 2006;1(4):2082-2087. DOI 10.1038/nprot.2006.355.

4. Chari R., Mali P., Moosburner M., Church G.M. Unraveling CRISPRCas9 genome engineering parameters via a library-on-library approach. Nature Methods. 2015;12(9):823-826. DOI 10.1038/nmeth.3473.

5. Datta S., Roychoudhury S., Ghosh A., Dasgupta D., Ghosh A., Chakraborty B., Roy S., Gupta S., Santra A.K., Datta S., Das K. Distinct distribution pattern of hepatitis B virus genotype C and D in liver tissue and serum of dual genotype infected liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma patients. PloS One. 2014;9(7):e102573. DOI 10.1371/journal.pone.0102573.

6. Fu Y., Foden J.A., Khayter C., Maeder M.L., Reyon D., Joung J.K., Sander J.D. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 2013;31(9): 822-826. DOI 10.1038/nbt.2623.

7. Golding S.E., Rosenberg E., Khalil A., McEwen A., Holmes M., Neill S., Povirk L.F., Valerie K. Double strand break repair by homologous recombination is regulated by cell cycle- independent signaling via ATM in human glioma cells. J. Biol. Chemistry. 2004; 279(15):15402-15410. DOI 10.1074/jbc.M314191200.

8. Hogan B., Beddington R., Costantini F., Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.

9. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-821. DOI 10.1126/science.1225829.

10. Kistler K., Vosshall L., Matthews B. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Report. 2015; 11(1):51-60. DOI 10.1016/j.celrep.2015.03.009.

11. Kouranova E., Forbes K., Zhao G., Warren J., Bartels A., Wu Y. CRISPRs for optimal targeting: Delivery of CRISPR components as DNA, RNA, and protein into cultured cells and single-cell embryos. Hum. Gene Ther. 2016;27(6):464-475. DOI 10.1089/hum. 2016.009.

12. Kulkarni A.S., Fortunato E.A. Stimulation of homology-directed repair at I-SceI-induced DNA breaks during the permissive life cycle of human cytomegalovirus. J. Virology. 2011;85(12):6049-6054. DOI 10.1128/JVI.02514-10.

13. Li K., Wang G., Andersen T., Zhou P., Pu W.T. Optimization of genome engineering approaches with the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 2014;9(8):e105779. DOI 10.1371/journal.pone.0105779.

14. Liu Y.G., Chen Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 2007;43(5):649-650,652,654.

15. Pierce A.J., Hu P., Han M., Ellis N., Jasin M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes & Development. 2001;15(24):3237-3242. DOI 10.1101/gad.946401.

16. Pierce A.J., Johnson R.D., Thompson L.H., Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes & Development. 1999;13(20):2633-2638.

17. Sakurai T., Kamiyoshi A., Kawate H., Mori C., Watanabe S., Tanaka M. A non-inheritable maternal Cas9-based multiple-gene editing system in mice. Sci. Reports. 2016;6:20011. DOI 101038/srep20011.

18. Sambrook J.F., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

19. Shchelkunov S.N. Geneticheskaya inzheneriya [Genetic Engineering]. Novosibirsk, 2004. (in Russian)

20. Smirnov A.V., Yunusova A.M., Lukyanchikova V.A., Battulin N.R. CRISPR/Cas9: a universal tool for genomic engineering. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2016;20(4):493-510. DOI 10.18699/VJ16.175. (in Russian)

21. Smith A.M., Takeuchi R., Pellenz S., Davis L., Maizels N., Monnat R.J., Stoddard B.L. Generation of a nicking enzyme that stimulates sitespecific gene conversion from the I-AniI LAGLIDADG homing endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. 2009;106(13):5099-5104. DOI 10.1073/pnas.0810588106.

22. Windbichler N., Papathanos P.A., Catteruccia F., Ranson H., Burt A., Crisanti A. Homing endonuclease mediated gene targeting in Anopheles gambiae cells and embryos. Nucl. Acids Res. 2007;35(17): 5922-5933. DOI 10.1093/nar/gkm632.

23. Yang H., Wang H., Jaenisch R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas- mediated genome engineering. Nat. Protocols. 2014;9:1956-1968.