Создание стабильного штамма-продуцента полноразмерного антитела человека на примере антитела против вируса эктромелии

Полноразмерные антитела человека обладают большим терапевтическим потенциалом, однако разработка стабильных штаммов, обеспечивающих высокий уровень продукции полноразмерных антител, является непростой задачей, поскольку молекулы антител содержат два типа полипептидных цепей. При получении штаммапродуцента чаще всего используют подход, основанный на случайной интеграции в геном плазмиды, содержащей ген, который коди рует целевой белок. Цель данного исследования – разработка оригинальной экспрессионной системы на основе направленной рекомбинации (генный таргетинг) для интеграции гена, кодирующего полноразмерное антитело человека, в транскрипционно активную область генома эукариотических суспензионных клеток CHO­S. Для создания высокопродуктивного стабильного штамма на первом этапе была сконструирована кассетная векторная плазмида pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL, содержащая сайт гомологичной рекомбинации и гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи полноразмерного антитела человека класса IgG1/kappa. ДНК плазмиды pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL организовали таким образом, что перед последовательностями, кодирующими константные домены тяжелых и легких цепей антитела человека, находились сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции для удобного встраивания фрагментов ДНК, кодирующих соответствующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей. На втором этапе в кассетную плазмиду pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL были встроены ДНК­фрагменты, кодирующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей антитела человека против ортопоксвирусного белка р35. Затем полученной плазмидой трансфицировали эукариотические клетки CHO­S/FRT, содержащие FRT­сайт гомологичной рекомбинации и экспрессирующие белок GFP. При встройке целевых генов, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела в FRT­сайт, продукция GFP должна была прекратиться. При использовании такой системы отбора был получен стабильный клон, продуцирующий целевое антитело fh8E с уровнем продукции около 100 мкг/мл. Аффинность связывания очищенного антитела fh8E с таргетным белком, измеренная методом поверхностного плазмонного резонанса, составила 12 нM. Антитело fh8E продемонстрировало вируснейтрализующие свойства в реакции ингибирования бляшкообразования вируса осповакцины в экспериментах in vitro.

: полноразмерное антитело человека, штаммпродуцент, клетки CHO, плазмида, геномная амплификация, вирус эктромелии

1. Baykov I.K., Khlusevich Ya.A., Matveev A.L., Tikunova N.V. Construction of cassette vector plasmids for production of full-size recombinant antibodies. Vestnik NGU: Seriya biologicheskaya, klinicheskaya meditsina = Herald of the Novosibirsk State University. Series: Biology and clinical medicine. 2013;11(3):56-64. (in Russian)

2. Baykov I.K., Matveev A.L., Stronin O.V., Ryzhikov A.B., Matveyev L.E., Kasakin M.F., Richter V.A., Tikunova N.V. A protective chimeric antibody to tick-borne encephalitis virus. Vaccine. 2014; 32(29):3589-3594.

3. Coroadinha A.S., Schucht R., Gama-Norton L., Wirth D., Hauser H., Carrondo M.J. The use of recombinase mediated cassette exchange in retroviral vector producer cell lines: predictability and efficiency by transgene exchange. J. Biotechnol. 2006;124(2):457-468.

4. Crickard L., Babas T., Seth S., Silvera P., Koriazova L., Crotty S. Protection of rabbits and immunodeficient mice against lethal poxvirus infections by human monoclonal antibodies. PLoS ONE. 2012; 7(11):e48706.

5. Fernandez J., Yaman I., Merrick W.C., Koromilas A., Wek R.C., Sood R., Hensold J., Hatzoglou M. Regulation of internal ribosome entry sitemediated translation by eukaryotic initiation factor-2α phosphorylation and translation of a small upstream open reading frame. J. Biol. Chem. 2002;277(3):2050-2058.

6. Hirata R., Chamberlain J., Dong R., Russell D.W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 2002;20:735-738.

7. Hopkins R.J., Lane J.M. Clinical efficacy of intramuscular vaccinia immune globulin: a literature review. Clin. Infect. Dis. 2004;39(6): 819-826.

8. Huang Y., Li Y., Wang Y.G., Gu X., Wang Y., Shen B.F. An efficient and targeted gene integration system for high-level antibody expression. J. Immunol. Methods. 2007;322(1-2):28-39.

9. Kameyama Y., Kawabe Y., Ito A., Kamihira M. An accumulative site-specific gene integration system using Cre recombinase-mediated cassette exchange. Biotechnol. Bioeng. 2010;105(6):1106-1114.

10. Khlusevich Y.A., Morozova V., Pyshnyi D.V., Tikunova N.V. Antibodies against ectromelia virus capable of neutralizing variola virus: generation and application for epitope mapping. FEBS J. 2013; 280(S1):371-372.

11. Khlusevich Y.A., Tikunova N., Morozova V., Bulychev L., Bormotov N., Vlasov V., Sergeev A. Sredstvo dlya neytralizatsii virusa natural’noy ospy [The agent for neutralizing variola virus]. Patent RF No. 2515905, 2014б. (in Russian)

12. Khlusevich Ya., Tikunova N., Morozova V., Grigor’eva A., Baykov I., P’yankov O. Rekombinantnaya plazmidnaya DNK pQE-p35d, obespechivayushchaya sintez rekombinantnogo belka p35d virusa ospy korov, shtamm bakteriy Escherichia coli – produtsent rekombinantnogo belka r35d virusa ospy korov i rekombinantnyy belok r35d virusa ospy korov, ispol’zuemyy dlya sozdaniya test-sistem i konstruirovaniya sub’edinichnykh vaktsin protiv ortopoksvirusnykh infektsiy [Recombinant plasmid DNA pQE-p35d providing synthesis of p35d recombinant protein of cowpox virus, Escherichia coli bacterial strain that is producer of p35d recombinant protein of cowpox virus and p35d recombinant protein of cowpox virus used to engineer test systems and to design orthopoxvirus split vaccines]. Patent RF No. 2511037, 2014а. (in Russian)

13. Kito M., Itami S., Fukano Y., Yamana K., Shibui T. Construction of engineered CHO strains for high-level production of recombinant proteins. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002;60(4):442-448.

14. Kwaks T.H., Barnett P., Hemrika W., Siersma T., Sewalt R.G., Sa tijn D.P., Brons J.F., van Blokland R., Kwakman P., Kruckeberg A.L., Kelder A., Otte A.P. Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 2003;21(5):553-558.

15. Little M., Breitling F., Dübel S., Fuchs P., Braunagel M., Seehaus T., Klewinghaus I. Universal antibody libraries on phage and bacteria. Year Immunol. 1993;7:50-55.

16. Lucas B.K., Giere L.M., DeMarco R.A., Shen A., Chisholm V., Crowley C.W. High-level production of recombinant proteins in CHO cells using a dicistronic DHFR intron expression vector. Nucleic Acids Res. 1996;24(9):1774-1779.

17. Matho M.H., Schlossman A., Meng X., Benhnia M.R., Kaever T., Buller M., Doronin K., Parker S., Peters B., Crotty S., Xiang Y., Zajonc D.M. Structural and functional characterization of anti-A33 antibodies reveal a potent cross-species orthopoxviruses neutralizer. PLoS Pathog. 2015;11.

18. McCausland M.M., Benhnia M.R., Crickard L., Laudenslager J., Granger S.W., Tahara T., Kubo R., Koriazova L., Kato S., Crotty S. Combination therapy of vaccinia virus infection with human anti-H3 and anti-B5 monoclonal antibodies in a small animal model. Antivir. Ther. 2010;15(4):661-675.

19. Mutskov V., Felsenfeld G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. EMBO J. 2004;23(1):138-149.

20. Petrov I.S., Goncharova E.P., Kolosova I.V., Pozdnyakov S.G., Shchelkunov S.N., Zenkova M.A., Vlasov V.V. Antitumor effect of the LIVPGFP recombinant vaccinia virus. Doklady RAN = Proceedings of the Russian Academy of Sciences. 2013;451(5):592-597. DOI 10.7868/ S0869565213240274. (in Russian)

21. Reichert J.M. Antibodies to watch in 2016. MAbs. 2016;8(2):197-204.

22. Reichert J.M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 2017;9(2):167-181.

23. Richards E.J. Chromatin methylation: who’s on first? Curr. Biol. 2002; 12(20):694-695.

24. Tasic B., Miyamichi K., Hippenmeyer S., Dani V.S., Zeng H., Joo W., Zong H., Chen-Tsai Y., Luo L. Extensions of MADM (Mosaic Ana lysis with Double Markers) in mice. PLoS ONE. 2012;7(3):e33332. DOI 10.1371/journal.pone.0033332.

25. Tikunova N., Dubrovskaya V., Morozova V., Yun T., Khlusevich Y., Bormotov N., Laman A., Brovko F., Shvalov A., Belanov E. The neutralizing human recombinant antibodies to pathogenic Orthopoxviruses derived from a phage display immune library. Virus Res. 2012;163(1):141-150.

26. Wilson C.J., Guglielmo C., Moua N.D., Tudor M., Grosveld G., Young R.A., Murray P.J. Yeast artificial chromosome targeting technology: an approach for the deletion of genes in the C57BL/6 mouse. Anal. Biochem. 2001;296(2):270-278.

27. Wirth D., Gama-Norton L., Riemer P., Sandhu U., Schucht R., Hauser H. Road to precision: recombinase-based targeting technologies for genome engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 2007;18(5): 411-409.

28. Zahn-Zabal M., Kobr M., Girod P.A., Imhof M., Chatellard P., de Jesus M., Wurm F., Mermod N. Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions. J. Biotechnol. 2001;87(1):29-42.