Пространственная организация, форма молекулы ДНК являются ключевой характеристикой, определяющей ее функциональную специфичность и природу межмолекулярных взаимодействий. Специфическая форма, которую молекула ДНК принимает при определенных условиях, обусловлена ее микромеханическими и структурными особенностями, зависящими от последовательности нуклеотидов. Следовательно, отдельные характеристики формы ДНК могут быть прогнозированы. Предложен ряд моделей для описания внутренней кривизны ДНК, включа ющий набор геометрических параметров двойной спирали, при­
меняемых при компьютерной реконструкции пространственных структур. С другой стороны, необходимые пара метры пар оснований можно рассчитать исходя из общедоступной информации атомной структуры ДНК. Принимая пары оснований как твердые тела, их относительное распо ложение в пространстве можно оценить по полученным параметрам. Матрицы являются наиболее распространенным способом реализации преобразований твердого тела и широко используются в моделировании формы ДНК. Более простая и надежная альтернатива матрицам – кватернионы. Единичные кватернионы представляют только поворот, тогда как двойные кватернионы объединяют в себе и поворот, и смещение. В настоящем руководстве алгебра единичных и двойных кватернионов впервые применена для моделирования траектории молекулы ДНК исходя из конформационных параметров динуклеотидных шагов. Хотя использование двойных кватернионов опти мально для детального моделирования структуры, единич ные кватернионы достаточны для прогнозирования траек тории двойной спирали и последующих расчетов ее простран­
ственных характеристик. Обсуждаются широко используемые, а также оригинальные алгоритмы вычисления кривизны, радиуса гирации, персистентной длины и фазирования статических изгибов для анализа формы молекулы, вычисления статистики полимерной цепи и прогнозирования микромеханических свойств на основе координат траектории ДНК­спирали. Приведенные алгоритмы будут полезны как в ходе in silico анализа относительно коротких фрагментов ДНК, так и в топологическом картировании полных геномов.

Взаимодействия между белком и ДНК по существу лежат в основе всех процессов, происходящих в живой клетке. Познание принципов специфического распознавания сайтов ДНК позволит понять, как управляются эти процессы, и даст возможность сознательно вмешиваться в управление ими. В работе изучены методом Вороного – Делоне контакты белок­ДНК на атомном уровне в структу рах 3 518 комплексов из PDB (все имеющиеся на май 2017 г.), содержащих как белковые цепи, так и ДНК. Метод не содержит параметров и позволяет однозначно выявлять непосредственные контакты между атомами и характеризовать каждый контакт, помимо расстояния между атомами, площадью контакта, определяемой соответствующей гранью полиэдра Вороного. Показано, что большая часть контактов образуется между атомами белка и атомами са ха­ рофосфатного остова ДНК (72.9 %). На контакты с атомами нуклеиновых оснований, выходящих в бороздки ДНК, приходится для большой бороздки 17.0 % и для малой бороздки 10.1 % от всех атомных контактов. Суммарно на взаимодействия между атомами белка и атомами нуклеиновых оснований приходится 27.1 % всех атомных контактов. Анализ площади доступной поверхности атомов большой и малой бороздок показал, что она коррелирует с числом контактов (коэффициенты линейной корреляции 0.94 и 0.93 соответственно), однако атомы нуклеиновых оснований, образующие водородные связи, контактируют чаще, чем этого можно было ожидать из статистических соображений. Показано, что конформационно­стабильные пептиды достаточно часто встречаются в областях связывания с ДНК. Анализ остатков в предопределенной конформации в 3 518 комплексах белок­ДНК выявил 159 аминокислотных остатков в предопределенной конформации β­изгиба типа I, 15 остатков в конформации β­изгиба типа I’ , 6 остатков в конформации β­изгиба типа II. Остатков в конформации β­изгиба типа II’ найдено не было. Анализ контактов показал, что такие остатки практически не образуют контактов с ДНК. Контакты с атомами нуклеиновых оснований найдены только в двух гомологичных структурах 3qea и 3qe9, где атомы треонина образуют контакты с атомами нуклеиновых оснований АТ­пары.

Генные сети – это молекулярно­генетические системы, обеспечивающие формирование фенотипических характеристик организ­
мов (молекулярных, биохимических, структурных, морфологических, поведенческих и т. д.) на основе информации, закодированной в их геномах. Реконструкция генных сетей обеспечивает методическую основу современной системной биологии. Большую ценность представляет информация о структурно­функциональной организации генных сетей, накопленная в современных базах данных. В настоящем обзоре представлена характеристика интернет­доступных информационных ресурсов, ориентированных на человека и животных и содержащих данные по генным сетям и их функциональным модулям. Не претендуя на полноту охвата абсолютно всех информационных ресурсов, содержащих данные, относящиеся к человеку и животным по этой тематике, предложенный обзор создан для того, чтобы оценить современное состояние проблемы, а также представить критерии, согласно которым целесообразно оценивать полезность информационных ресурсов для конкретных исследовательских задач. Исходя из этого нами, во­первых, была сформирована и охарактеризована подборка баз данных, содержащих сведения о метаболических и сигнальных путях, а также о путях регуляции биологических процессов на клеточном и организменном уровнях. Во­вторых, в качестве примера описаны несколько известных баз данных по меж молекулярным взаимодействиям различных типов. В обзоре рас сматриваются следующие характеристики баз данных: 1) типы на копленной информации; 2) способы представления информации; 3) способы наполнения баз данных; 4) основные источники инфор мации; 5) программные средства, позволяющие осуществлять поиск и анализ данных. Сопоставление перечисленных характеристик показало, что рассмотренные базы данных очень гетерогенны по тематике, источникам, типам и способу представления информации, а также по возможностям формировать запросы и анализировать данные. Делается вывод о том, что до начала реконструкции генной сети определенного биологического процесса очень важно иметь пред ставление о максимально полном наборе информационных источников, из которых может быть взята информация. Приведены примеры веб­порталов, аккумулирующих сведения о базах данных и информационных ресурсах, которые могут быть полезны для реконструкции и анализа генных сетей.

В статье представлены результаты исследования тканеспецифичности циркадных фазовых характеристик биологических процессов в печени и почках мыши. Основываясь на экспериментальных данных по суточной динамике уровня трансляции генов мыши из базы данных GEO (GSE67305 и GSE81283), полученных методом профилирования рибосом в печени и почках, мы провели сравнительный анализ транслятомов в этих двух органах. Были выявлены гены, демонстрирующие выраженную суточную динамику трансляции (3 358 генов в печени и 2 938 в почках). Далее для двенадцати временных точек (ZT0–ZT22) в каждой ткани (печень, почки) были выделены группы генов, находящиеся в фазе с повышенным уровнем трансляции. В работе было принято, что ген находится в фазе с повышенным уровнем трансляции, если в данной временной точке его показатель профилирования рибосом для обеих реплик превышал среднесуточное значение показателя для этого гена. Наибольшее количество ритмичных генов в печени имеет повышенный уровень трансляции в начале темной фазы суток, соответствующей повышенной активности животных. В почках различия в распределении по времени суток числа генов, находящихся в фазе повышенного уровня трансляции, были менее выражены, а максимальное число таких генов наблюдалось с середины светлой фазы суток до середины темной. Был проведен анализ обогащения терминами GO категории Biological Process этих двенадцати групп генов в печени и почках. Среди процессов, ритмичность которых характерна как для печени, так и для почек, выявлены процессы, циркадные фазовые характеристики которых в этих тканях совпадают, и процессы, имеющие существенно различные временные фазовые паттерны. Также выявлены процессы со строгой тканеспецифичностью ритмической трансляции. Подход, использованный в нашей работе, позволяет проводить анализ органо/тканеспеспецифичности фазовых характеристик биологических процессов, а полученные результаты подчеркивают необходимость учитывать фазовые циркадные характеристики при сравнении особенностей протекания биологических процессов в различных органах.

Агрессивное поведение животных играет важную роль при защите территории, потомства, установлении социально­иерархических отношений и т. д. При ряде заболеваний (шизофрения, маниакально­депрессивный психоз, нейродегенеративные заболевания) наблюдается повышенная агрессия. В нейрогенезе большое значение в поддержании клеточного гомеостаза имеет нейрональный апоптоз. Нарушения нейронального апоптоза отмечаются при старении и различных нейропатологиях (эпилепсия, болезнь Альцгеймера, нейротравмы), сопровождающихся изменениями психоэмоционального состояния. Известно, что в мозге высокоагрессивных крыс значительно изменяется уровень экспрессии ключевых генов нейронального апоптоза (Casp3, Bax и Bcl-xl). В связи с этим актуальным является изучение связей нейронального апоптоза и агрессивного поведения. Целью данной работы был анализ ассоциативных сетей, описывающих молекулярно­генетические взаимодействия между генами/белками, вовлеченными в нейрональный апоптоз, дифференциально экспрессированными генами и генами, имеющими полиморфизмы, у серых крыс с агрессивным поведением. Выявлено 819 дифференциально экспресси рующихся генов в гипоталамусе, вентральной тегментальной об ласти и в сером веществе периакведуктума у крыс с агрессивным и дружелюбным поведением. Анализ ассоциативной сети диффе ренциально экспрессирующихся генов позволил выявить три вершины с максимальной центральностью, которые соответство вали генам Stx1a, Mbp и Th. При анализе генома было  обнаружено 137 полиморфных генов, три из которых (Lig4, Parp1 и Pigt) вовлечены в нейрональный апоптоз. Показано, что среди генов, взаимодей ствующих в ассоциативной сети с генами, вовлеченными в нейро нальный апоптоз, статистически значимо представлены полиморфные и дифференциально экспрессированные гены (p-value < 0.01). Реконструированы три молекулярно­генетические цепочки, описывающие связи между полиморфными генами и генами/белками нейронального апоптоза, опосредованные через дифференциально экспрессированные гены. Цепочки включали полиморфные гены Tsc1, Adamts4 и Lgals3, дифференциально экспрессированные гены Ezr, Acan, Th и 19 генов нейронального апоптоза. Было показано, что процесс нейронального апоптоза тесно связан с агрессивным поведением у животных.

CIMP+ (CpG-­Island Methylator Phenotype) опухоли характеризуют ся плотным метилированием промоторных CpG­островков одновременно многих генов и представляют отдельную группу злокачественных новообразований толстой кишки. Несмотря на то что диагностика CIMP+ опухолей имеет значительную прогностическую ценность, до сих пор не разработано эффективного  набора маркеров для их выявления. Для определения CpG­сайтов, уро вень метилирования которых может быть использован для идентификации CIMP+ опухолей, с помощью созданного ранее прило жения CrossHub нами проведен анализ профилей экспрессии и метилирования 297 образцов первичных опухолей и 38 парных к ним «условных норм» толстой кишки, представленных в базе проекта TCGA (The Cancer Genome Atlas). Разработан скоринг, учи тывающий уровень метилирования CpG­сайтов, их расположение, а также уровень экспрессии соответствующих генов.  Определено, что ста тус метилирования CpG­сайтов, относящихся к генам AMOTL1, ZNF43, ZNF134 и CHFR, является перспективным маркером CIMP+ опухолей. Более того, идентифицированы конкретные районы про моторных областей этих генов, уровень метилирования которых ассоциирован с исследуемым фенотипом. Для валидации полученных дан ных на независимой выборке, сначала оценили относительный уровень мРНК генов AMOTL1, ZNF43, ZNF134 и CHFR в 30 парных (опухоль/«условная норма») образцах толстой кишки методом количественной ПЦР. Для всех генов выявлено частое (50–60 % случаев) и значительное (2–30 раз) снижение экспрессии. Затем методом бисульфитной конверсии ДНК с последующим кло нированием и секвенированием исследовали статус метилирования CpG­сайтов, отобранных в результате биоинформатического анализа, и обна ружили высокий уровень метилирования (β­value = 0.3–0.9) в об разцах с одновременно сниженным уровнем экспрессии всех четырех генов и низкий уровень метилирования (β­value = 0.0–0.2) в образцах с неизменным уровнем экспрессии четырех генов и в «условных нормах». Таким образом, статус метилирования CpG­сайтов промоторных областей генов AMOTL1, ZNF43, ZNF134 и CHFR является перспективным потенциальным маркером CIMP+ опухолей толстой кишки.

Одним из важнейших направлений современной молекулярной генетики и биомедицины является поиск предиктивных маркеров, помогающих выбрать наиболее эффективный способ лечения и препарат, а также индивидуально подобрать его дозировку. Особенно перспективными считаются те маркеры, которые могут обеспечить возможность применения неинвазивной, так называемой жидкостной биопсии. Этот метод позволяет оценить состояние опухоли по анализу естественных жидкостей организма, таких как кровь, моча или слюна. Подобные исследования наиболее удобны в случаях, когда необходимо проводить мониторинг эффективности терапии, чтобы вовремя зафиксировать момент возникнове ния резистентности опухолевых клеток, начало рецидива и перей ти на следующую линию терапии. При лечении агрессивных и быстро метастазирующих злокачественных новообразований, таких как меланома, наличие достоверных маркеров, позволяющих быстро и точно определить тактику лечения, особенно  важно. В последнее время появляется все больше исследований, посвященных поиску предиктивных маркеров эффективности иммунотерапии. Меланома характеризуется высокой иммуногенностью, в связи с чем она стала модельным объектом для исследования и внедрения новых подходов иммунотерапии. В настоящей работе проведено сравнение двух групп больных метастатической меланомой кожи с различным ответом на иммунотерапию блокаторами иммунных контрольных точек с целью идентифицировать новые предиктивные экспрессионные биомаркеры среди микро­ и матричных РНК, а также определить гены, ответственные за возникновение объективного ответа на терапию у пациентов. В исследовании выявлено несколько микроРНК со значительным изменением содержания в опухолевой ткани пациентов, по­разному отвечающих на иммуно терапию. Обнаружены также различия на уровне экспрессии их генов­мишеней, которые позволят более детально проанализировать молекулярные механизмы, определяющие чувствительность или резистентность клеток злокачественной меланомы к действию иммунотерапии. На основе полученных результатов предложены экспрессионные маркеры (мРНК и микроРНК), кото рые после дальнейшей апробации могут быть использованы как предикторы ответа опухолей злокачественной меланомы к иммунотерапии.

Колоректальный рак (КРР) – одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований в мире, характеризующееся высоким уровнем смертности. Изучение ключевых аспектов формирования и прогрессии КРР необходимо для разработки новых подходов к его терапии, а также поиска новых диагностических, прогностических и предиктивных биомаркеров. Для многих видов опухолей важным изменением метаболизма является акти ва ция гликолиза, ассоциированная с нарушением экспрессии основных ферментов, принимающих участие в этом процессе, и регуляторных молекул. Чаще всего в опухолевых клетках наблюдается повышение экспрессии гексокиназы 2 (HK2), что делает ее многообещающей мишенью для таргетной терапии. В мо дифицированной нами клеточной линии RKO, постоянно экспрес сирующей короткие шпилечные РНК для ингибирования гексоки назы 2, проведен количественный анализ экспрессии 15 генов (GAPDH, ADPGK, ALDOA, ENO3, PFKL, PGK1, PGAM1, PKM2, ENO1, PDK1, PDK3, PFKP, ENO2, GPI и BPGM), кодирующих ключевые ферменты гликолиза, а также гена HIF1A. Выявлено значительное снижение экспрессии генов PFKP, BPGM и GPI на уровне мРНК (в 5, 86 и 93 раза соответственно) и белка (в 2.5, 3.5 и 19 раз соответственно). Вероятно, снижение экспрессии GPI и PFKP связано с уменьшением количества их субстратов, глюкозо­6­фосфата и фруктозо­6­фосфата, при подавлении гексокиназы 2. Однако вопрос о при чинах снижения уровня мРНК этих трех ферментов при одновременном сохранении уровня экспрессии других участников гликолиза требует дальнейшего изучения.

Применение некоторых вспомогательных репродуктивных технологий, в частности трансплантации эмбрионов, может вызывать различные физиологические и поведенческие изменения у потомства. Целью нашего исследования являлась проверка влияния хирургического вмешательства, используемого при трансплантации эмбрионов, на вес, артериальное давление и поведение в тестах «открытое поле» (ТОП) и «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) у взрослых потомков. В работе исследованы отсроченные эффекты хирургического воздействия на четвертые сутки беременности на потомков крыс линии OXYS. Самок линии OXYS спари­
вали с фертильными самцами той же линии, через 96 ч после обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках им проводили хирургическую операцию, имитирующую трансплантацию эмбрионов. У потомков самок, подвергавшихся хирургическому воздействию во время беременности (группа OXYS­PS), в возрасте 3 мес. измеряли вес тела, систолическое (САД) и диастолическое (ДАД) артериальное давление, а также исследовали поведение в тестах ТОП и ПКЛ. Контролем служили потомки интактных крыс OXYS. Средний вес у крыс линии OXYS не отличался от такового у крыс OXYS­PS. Крысы линий OXYS и OXYS­PS имели высокое САД, превышающее гипертензивный порог (150 мм рт. ст.), и высокое ДАД. При этом данные показатели достоверно выше у крыс OXYS­PS, чем у животных контрольной линии. У крыс OXYS­PS в тесте ТОП было снижено время, проведенное в центре арены, меньше исследованная область, а также снижено число стоек и их продолжительность по сравнению с крысами OXYS. Как показано в тесте ПКЛ, число выглядываний из закрытых рукавов и их длительность меньше у крыс OXYS­PS, чем в контроле. Таким образом, хирургическое воздействие, испытанное самкой OXYS на ранних стадиях беременности, приводит к следующим эффектам у потомков: повышение САД и ДАД, снижение исследовательской активности и повышение тревожности.

В последние десятилетия наблюдается резкое снижение численности популяций медоносных пчел и шмелей на территории большинства стран мира. Вклад в снижение численности данных опылителей вносят различные паразитические организмы (бактерии, грибы, простейшие, нематоды, клещи и насекомые). Паразиты рода Nosema (Microsporidia: Nosematidae) и родов Crithidia и Lotmaria (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) оказывают значительное негативное влияние на численность медоносных пчел и шмелей. В недавних исследованиях, проведенных с использованием ядерных ДНК­маркеров, были описаны новые виды и генетические варианты данных паразитов. Целью настоящей работы являлось установление уровня зараженности медоносных пчел и шмелей микроспоридиями (Nosema spp.) и трипаносоматидами (Crithidia spp. и Lotmaria passim), а также изучение генетической вариабельности этих паразитов на ранее не исследованной территории Индии. В работе проанализировано 119 образцов из четырех видов медоносных пчел и пяти видов шмелей. Уровни зараженности популяций пчел и шмелей паразитическими организмами на территории двух штатов (Джамму и Кашмир, Карнатака) были определены с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными к кластеру генов  рибосомной РНК Nosema, Crithidia и Lotmaria. Совместное заражение популяций медоносных пчел и шмелей микроспоридиями и трипаносоматидами было зафиксировано на территории штата Джамму и Кашмир. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей кластера генов рибосомной РНК установлено, что в популяциях медоносных пчел на территории Индии были представлены N. bombi, N. ceranae и L. passim. Популяции шмелей были поражены микроспоридией Nosema D и трипаносоматидами Crithidia bombi и Crithidia expoeki. В образцах медоносных пчел, собранных на территории штата Карнатака, паразиты родов Crithidia и Lotmaria не выявлены. В популяции медоносных пчел впервые выявлена микроспоридия N. bombi. Данные о распространении микроспоридий и трипаносоматид в популяциях медоносных пчел и шмелей по всему миру были обобщены и дополнены.

Стафилококки способны поражать практически любые органы и ткани организма человека, вызывая поверхностные и глубокие гнойные инфекции, поражения дыхательных и мочевыводящих путей, а также провоцировать пищевые отравления и интоксикации. В последние годы участились случаи заболеваний, возбудителями которых оказываются коагулазонегативные стафилококки. Такие виды, как Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticusb и Staphylococcus hominis значительно чаще выявляются при внутрибольничных инфекциях. Особая опасность этих патогенов заключается в повышенной вирулентности и патогенности штаммов, а также в их частой устойчивости к различным антибиотикам. Особенно трудно поддаются лечению заболевания, вызванные метициллин­резистентными стафилококками. Правильная идентификация стафилококков и их чувствительности к антибиотикам важна для постановки клинического диагноза и назначения адекватной лекарственной терапии. В связи с этим востребованы методы быстрого и точного определения видов стафилококков для оценки их патогенных свойств и наличия метициллин­резистентности. Цель данного исследования – характеризация стафилококков, в том числе и по устойчивости к антибиотикам, изолированных в г. Новосибирске из образцов, полученных от людей, животных и из окружающей среды. Проанализирована коллекция из 100 штаммов стафилококков. Видовая идентификация стафилококков проведена по результатам секвенирования гена 16S рРНК. Выявлено 11 видов стафилококков. Среди штаммов, полученных от больных из стационаров, доминировали Staphylococcus aureus (79.1 %), Staphylococcus epidermidis составили около 12.5 %. Среди внебольничных штаммов S. aureus и S. epidermidis выделены примерно в равных соотношениях. Обнаружение коагулазоположительных видов проводили стандартным биохимическим методом и выявлением гена cоa методом ПЦР в реальном времени. Для штаммов S. aureus показано 100 % совпадение результатов между наличием гена cоa и присутствием коагулазной активности, что свидетельствует о том, что выявление гена cоa может служить точным методом идентификации S. aureus. Получен высокий уровень совпадения (99 %) между наличием в клетках стафилококков гена mесА и фенотипической устойчивостью к оксациллину. Исследование стафилококков на присутствие гена mесА может рассматриваться как альтернатива фенотипическому методу обнаружения метициллин­резистентных штаммов стафилококков

В настоящее время в микробной экологии активно применяются методы метагеномного анализа, которые позволяют охарактеризовать таксономический состав и разнообразие микробных сообществ. Гидролитические бактерии, в частности протеолитики, в горячих источниках занимают нишу первичных деструкторов, благодаря способности секретировать фер­менты, активные в широких диапазонах значений рН и температур. Целью данной работы было определение таксономического состава, структуры бактериального микробного мата и выявление пептидаз в термофильном микробном сообществе Гарга. Гидрохимический анализ воды показал высокое содержание сульфатов – 390 мг/дм3. В микроэлементном составе воды отмечены повышенные концентрации B, Rb, Li, Ba и Sr. Проведен анализ таксономического разнообразия микробного мата в горячем источнике Гарга, в температурной зоне 54 °С. Структура микробного мата представлена разнообразными филогенетическими группами мезофильных и термофильных бактерий с различными метаболическими и экологическими функциями. Наибольшую долю в сообществе составил филум Firmicutes (64 %). Анализ собранных метагеномных последовательностей микробного мата позволил впервые систематизировать и дать характеристику выявленных пептидаз в микробном мате горячего источника Гарга. Сравнение метагеномных последовательностей репрезентативных данных выявило доминирование ферментов класса сериновых пептидаз. Природные пептидазы в исследуемом микробном сообществе обеспечивают гидролиз биополимеров на первых этапах деструкции органического вещества и могут представлять биотехнологический интерес.

Дефицит некоторых углеводов в традиционной диете коренного населения Крайнего Севера способствовал высокой распространенности в популяциях неактивных вариантов генов, кодиру ющих, например, амилазу (ген AMY2A) и сахаразу­изомальтазу (ген SI). Одним из малоусваиваемых коренными жителями Крайнего Севера дисахаридов является трегалоза, которая содержится в водорослях, высших грибах, лишайниках и некоторых высших растениях. В настоящей работе исследован полиморфизм гена TREH в популяциях Сибири. Этот ген кодирует трегалазу – фермент, расщепляющий трегалозу. Анализ экзомного полиморфизма показал наличие в популяциях семи гаплотипов гена TREH. Три из них определяются вариантом rs2276064­А, который ассоциируется с самой низкой активностью трегалазы. Максимальная частота гаплотипов этой группы наблюдается в выборках коренного населения Северо­Восточной Азии (около 60 %), в популяциях других регионов Сибири ее частота составляет 30–40 %. Таким образом, высокая частота варианта rs2276064­А, ассоциирующегося с мало­активной трегалазой, объясняет, почему коренные северяне избегают пищи, содержащей трегалозу. Предполагается, что увеличению частоты этого варианта в популяциях Северо­Востока Азии мог способствовать дрейф генов, действующий в популяциях малой эффективной численности. Однако не исключено, что искусственно вызванный дефицит трегалозы в пище коренных народов Крайнего Севера (вследствие традиции отказа от грибов) также мог стать причиной увеличения частоты малоактивной трегалазы при условии, что эта традиция существует у жителей Крайнего Севера на протяжении многих поколений.

Дрожжи являются модельным эукариотическим организмом, на котором отрабатываются многие предположения о работе генома, а также методы его редактирования. Наиболее часто в исследовательских работах используют Saccharomyces cerevisiae, которые очень хорошо приспособлены физиологически к культивированию в условиях биореактора и признаны абсолютно безопасными. В последнее десятилетие методы генетической инженерии дрожжей претерпели значительные изменения. Появились новые инструменты, которые пришли из смежных направлений и позволили значительно ускорить процесс получения новых штаммов. Прежде всего это белки для направленного внесения изменений в последовательность ДНК. Длительное время методы редактирования генома дрожжей базировались на использовании их собственной системы гомологичной рекомбинации. Она удобна и удовлетворяла потребности исследователей на протяжении нескольких десятилетий, до того времени, когда на первый план стали выходить высокопроизводительные методы. Во втором десятилетии XXI века произошло бурное развитие высокопроизводительных подходов, в первую очередь методов анализа в биологии: геномики, транскриптомики, протеомики, метаболомики, интерактомики и др. Сформировалась биоинформационная база, которая позволила быстро обрабатывать растущий поток информации и моделировать клеточные процессы. В результате скорость анализа и предсказания мишеней для редактирования генома стала превышать скорость их получения, что, естественно, обусловило поиск новых методов генетической инженерии. Особенно сильно этот процесс затронул работы по модификации свойств микроорганизмов. Современные задачи стали требовать не единичных модификаций, а десятков и сотен, а иногда тысяч модификаций. В результате исследователи, занимающиеся дрожжами, стали вовлекать в работу новые инструменты геномного редактирования, которые ранее развивались для изучения более сложных объектов, таких как животные, растения, клеточные линии и др. Современные методы геномной инженерии дрожжей позволяют вносить несколько модификаций в геном за один шаг. В данном обзоре рассматривается вопрос применения и перспектив дальнейшего развития методов направленного редактирования генома в инженерии дрожжей.

Рынок фармацевтически ценных белков – наиболее быстро развивающийся сегмент экономики. Большая часть биофармацевтиков получена в клетках млекопитающих и микроорганизмов, однако обе системы обладают рядом недостатков. Растительные клетки сочетают в себе достоинства эукариотической системы наработки белка и простоту и дешевизну бактериальной. Использование растений для получения рекомбинантных белков – экономически значимое и перспективное направление. Преимуществом растительных систем является более низкая стоимость культивирования клеток. Они свободны от нежелательных компонентов, таких как эндотоксины бактерий, гипергликозилированные белки, продуцируемые дрожжами, патогены животных и человека в клеточных культурах трансгенных животных. Растения относятся к высшим эукариотам, поэтому в их клетках происходит полноценный фолдинг и образование сложных мультимерных белковых комплексов, а также значительная часть посттрансляционных модификаций аналогично таковым в клетках млекопитающих. Развиваемые ныне растительные системы экспрессии рекомбинантных белков чрезвычайно разнообразны и насчитывают более 100 различных технологий, основанных на разных видах растений, способах переноса генов, экспрессионных стратегиях, методах последующего извлечения целевого белка и пр. К ним относятся ядерная и пластидная трансформация, транзиентная и стабильная экспрессия при трансформации с помощью агробактериального переноса, бомбардировки или электропорации, культивирование целых наземных или водных растений, растительных тканей или суспензионных клеточных культур в качестве экспрессионных систем. В обзоре анализируется современное состояние исследований в области использования растительных систем экспрессии для наработки рекомбинантных фармацевтических белков. Сделан акцент на преимуществах культур растительных клеток по сравнению с другими системами экспрессии. Описаны растительные системы для наработки рекомбинантных белков, такие как транспластомные растения, культуры мхов и водных растений, а также суспензионные культуры клеток высших растений. Рассмотрено современное состояние рынка рекомбинантных белков, полученных с применением растительных систем экспрессии. Обсуждаются перспективы растительных («съедобных») вакцин, созданных на основе генетически модифицированных растений.

В настоящей работе описаны конструирование гена,  кодирующего гибридный белок flagG­protE, синтез и очистка полученного рекомбинантного белка, а также исследование его антигенных характеристик на панели моноклональных антител (МКА). Рекомбинантный белок flagG­protE является перспективной молекулой для создания кандидатной рекомбинантной вакцины против клещевого энцефалита благодаря способности к связыванию с МКА против природного белка Е вируса клещевого энцефалита. Проведено исследование антигенных детерминант двух рекомбинантных бел ­ ков protE и flagG­protE с помощью панели из восьми МКА. Рекомбинантный белок protE представлен белком оболочки вируса клещевого энцефалита, в рекомбинантном белке flagG­protE к нему добавлен домен flagG, кодирующий флагеллин G Salmonella typhi. Установлено, что изучаемые МКА связывались с эпитопами ре ­ комбинантного белка protE. Это свидетельствует о том, что исследуемый рекомбинантный белок имеет антигенную структуру, схожую с антигенной структурой нативного белка Е вируса клещевого энцефалита. При исследовании рекомбинантного белка flagG­protE по способности к связыванию с панелью из восьми МКА только пять из них были способны связываться с эпитопами рассматриваемого белка. МКА 4F6, 7F10 и 6B9 не узнавали соответствующий эпитоп рекомбинантного белка flagG­protE, тогда как в рекомбинантном белке protE эти эпитопы выявлялись успешно. Полученные данные свидетельствуют о том, что антигенная структура рекомбинантного protE­белка может быть изменена под влиянием флагеллинового домена, что, в свою очередь, может привести к недоступности некоторых антигенных детерминант. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании рекомбинантных антигенов. Тем не менее принципиально важные районы в области пептида слияния и домена III оказались доступны для антител. Это должно обеспечить формирование нейтрализующих антител, а на личие полной аминокислотной последовательности белка Е в составе рекомбинантного белка будет индуцировать формирование Т­клеточного иммунного ответа. Появление нового поколения вакцин против клещевого энцефалита с более высоким уровнем безопасности и иммуногенности позволит усовершенствовать вакцинопрофилактику населения от клещевого  энцефалита.

Полноразмерные антитела человека обладают большим терапевтическим потенциалом, однако разработка стабильных штаммов, обеспечивающих высокий уровень продукции полноразмерных антител, является непростой задачей, поскольку молекулы антител содержат два типа полипептидных цепей. При получении штаммапродуцента чаще всего используют подход, основанный на случайной интеграции в геном плазмиды, содержащей ген, который коди рует целевой белок. Цель данного исследования – разработка оригинальной экспрессионной системы на основе направленной рекомбинации (генный таргетинг) для интеграции гена, кодирующего полноразмерное антитело человека, в транскрипционно активную область генома эукариотических суспензионных клеток CHO­S. Для создания высокопродуктивного стабильного штамма на первом этапе была сконструирована кассетная векторная плазмида pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL, содержащая сайт гомологичной рекомбинации и гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи полноразмерного антитела человека класса IgG1/kappa. ДНК плазмиды pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL организовали таким образом, что перед последовательностями, кодирующими константные домены тяжелых и легких цепей антитела человека, находились сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции для удобного встраивания фрагментов ДНК, кодирующих соответствующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей. На втором этапе в кассетную плазмиду pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL были встроены ДНК­фрагменты, кодирующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей антитела человека против ортопоксвирусного белка р35. Затем полученной плазмидой трансфицировали эукариотические клетки CHO­S/FRT, содержащие FRT­сайт гомологичной рекомбинации и экспрессирующие белок GFP. При встройке целевых генов, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела в FRT­сайт, продукция GFP должна была прекратиться. При использовании такой системы отбора был получен стабильный клон, продуцирующий целевое антитело fh8E с уровнем продукции около 100 мкг/мл. Аффинность связывания очищенного антитела fh8E с таргетным белком, измеренная методом поверхностного плазмонного резонанса, составила 12 нM. Антитело fh8E продемонстрировало вируснейтрализующие свойства в реакции ингибирования бляшкообразования вируса осповакцины в экспериментах in vitro.