Получение микродиссекционных ДНК-проб из метафазных хромосом в случае невозможности идентификации целевой хромосомы методами рутинного окрашивания

При проведении многочисленных и разнообразных молекулярно-цитогенетических исследований микродиссекционные ДНК-библиотеки и ДНК-пробы зарекомендовали себя как надежный и эффективный инструмент как в диагностике и анализе хромосомных патологий человека, так и в работах, посвященных изучению реорганизации хромосом в ходе кариотипической эволюции. Важным преимуществом микродиссекционных ДНК-проб перед хромосомоспецифичными ДНК-пробами, полученными с помощью хромосомного сортинга, является возможность их приготовления из хромосомного материала индивидуальных животных без дополнительного этапа создания клеточных культур, предназначенных для производства большого числа метафазных хромосом. Одно из основных условий успешного использования микродиссекционной техники – идентификация целевой хромосомы на препаратах метафазных хромосом, что позволяет, используя микроманипуляционную технику, осуществлять сбор непосредственно ее материала с цитологических препаратов. В настоящей работе предложена технология создания ДНК-проб для индивидуальных хромосом даже в том случае, когда рутинное окрашивание не дает провести их надежную идентификацию. Представленный подход апробирован при получении наборов хромосомоспецифичных ДНКпроб для хромосом двух видов свободноживущих плоских червей рода Macrostomum – M. mirumnovem и M. cliftonensis. Кариотипы этих видов содержат три пары мелких, близких по размеру метацентрических хромосом, надежная идентификация которых после окрашивания красителем Гимза оказалась невозможной. Раздельный сбор всех метафазных хромосом из одной метафазной пластинки с последующей амплификацией их ДНК позволил создать ДНК-пробы, специфически окрашивающие исходные хромосомы при проведении даже частичной супрессионной гибридизации in situ. При анализе результатов такой супрессионной гибридизации in situ идентифицированы хромосомы, из которых были получены ДНК-пробы. Последующее пулирование ДНК-проб, созданных из гомологичных хромосом, способствовало увеличению интенсивности их специфического окрашивания при проведении их супрессионной гибридизации in situ. Это, в свою очередь, обеспечило возможность успешного применения предлагаемого подхода в экспериментах, посвященных изучению кариотипической эволюции в роде Macrostomum, а также при анализе хромосомных перестроек, имеющих место в лабораторных культурах M. mirumnovem.

1. Ferguson-Smith M.A., Trifonov V. Mammalian karyotype evolution. Nat. Rev. Genet. 2007;8(12):950-962. DOI 10.1038/nrg2199.

2. Graphodatsky A.S., Yang F., O’Brien P.C.M., Serdukova N., Milne B.S., Trifonov V., Ferguson-Smith M.A. A comparative chromosome map of the Arctic fox, Red fox and dog defined by chromosome painting and high resolution G-banding. Chromosome Res. 2000;8(3):253-263. DOI 10.1023/A:1009217400140.

3. Nesterova T., Rubtsov N., Zakian S., Matveeva V., GraphodatskyA. Mapping of the silver fox genes: assignments of the genes for ME1, ADK, PP, PEPA, GSR, MPI, and GOT1. Cytogenet. Cell Genet. 1991;56(2):125-127. DOI 10.1159/000133065.

4. Rubtsov N., Graphodatsky A., Matveeva V., Radjabli S., Nesterova T., Kulbakina N., Zakian S. Silver fox gene mapping: conserved chromosome regions in the order Carnivora. Cytogenet. Cell Genet. 1988;48(2):95-98. DOI 10.1159/000132598.

5. Rubtsov N., Radjabli S., Gradov A., Serov O. Chinese hamster× American mink somatic cell hybrids: characterization of clone panel and assignment of the genes for malate dehydrogenaseNADP-1 and malate dehydrogenase-NAD-1. Theor. Appl. Genet. 1981;60:99. DOI 10.1007/BF00282425.

6. Schärer L., Brand J.N., Singh P., Zadesenets K.S., Stelzer C.‐P., Viktorin G.A phylogenetically informed search for an alternative Macrostomum model species, with notes on taxonomy, mating behavior, karyology, and genome size. J. Zool. Syst. Evol. Res. 2020;58:41-65. DOI 10.1111/jzs.12344.

7. Zadesenets K.S., Ershov N.I., Berezikov E., Rubtsov N.B. Chromosome evolution in the free-living flatworms: first evidence of intrachromosomal rearrangements in karyotype evolution of Macrostomum lignano (Platyhelminthes, Macrostomida). Genes. 2017a;8:298. DOI 10.3390/genes8110298.

8. Zadesenets K., Jetybayev I., Schärer L., Rubtsov N. Genome and karyotype reorganization after whole genome duplication in free-living flatworms of the genus Macrostomum. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21:680. DOI 10.3390/ijms21020680.

9. Zadesenets K.S., Schӓrer L., Rubtsov N.B. New insights into the karyotype evolution of the free-living flatworm Macrostomum lignano (Platyhelminthes, Turbellaria). Sci. Rep. 2017b;7:6066. DOI 10.1038/s41598-017-06498-0.

10. Zadesenets K.S., Vizoso D.B., Schlatter A., Konopatskaia I.D., Berezikov E., Schärer L., Rubtsov N.B. Evidence for karyotype polymorphism in the free-living flatworm, Macrostomum lignano, a model organism for evolutionary and developmental biology. PLoS One. 2016;11:e0164915. DOI 10.1371/journal.pone.0164915.