Увеличение доли трансгенных растений в потомстве трансформантов рапса Brassica napus L.

Семядольные и листовые экспланты двух сортов ярового рапса (канолы) были трансформированы с использованием Agrobacterium tumefaciens, несущими генетическую конструкцию с геном-маркером gfp. Для уменьшения доли витрифицированных побегов-регенерантов мы оптимизировали содержание сахарозы в среде регенерации. Анализ потомства, полученного от растений поколения T0, показал, что в ряде линий распределение маркера gfp не подчинялось сегрегации моногенного признака по Менделю для самоопыляемых растений, в то время как в потомстве других линий маркер gfp полностью отсутствовал, хотя его присутствие было подтверждено у всех отобранных растений T0. Обнаружено, что у индивидуальных трансформантов gfp наследуется случайным образом по всему центральному цветоносу, его наличие в геноме проростков не зависело от местоположения стручка. Таким образом, в образовании гамет растений T0 участвовали оба типа клеток – трансформированные и нетрансформированные. Помимо того, сегрегация маркера различалась у растений линий T1, полученных черенкованием первичного трансформанта, в зависимости от местоположения черенка на стебле исходного растения, что указывает на химерность растений данного поколения. Далее установлено, что черенкование растений с последующим размножением семенами, образовавшимися в результате самоопыления, приводило к увеличению доли трансгенных растений в следующих поколениях. Полученные результаты показывают, что трансформанты были химерными, т. е. их ткани содержали как трансгенные, так и нетрансгенные клетки, и эта химерность передавалась в последующие поколения. Кроме состава питательных сред, на появление химерных растений во время трансформации влияют такие факторы, как генотип растения и тип экспланта. Основываясь на этих результатах, мы разработали упрощенный метод, состоящий из нескольких раундов комбинации черенкования, получения семян методом самоопыления и последующей отбраковки растений дикого типа, который позволил значительно обогатить популяции потомков исходных трансформантов рапса растениями, трансгенными по маркеру gfp.

1. Aragão F.J.L., Barros L.M.G., Brasileiro A.C.M., Ribeiro S.G., Smith F.D., Sanford J.C., Faria J.C., Rech E.L. Inheritance of foreign genes in transgenic bean (Phaseolus vulgaris L.) co-transformed via particle bombardment. Theor. Appl. Genet. 1996;93:142-150. DOI 10.1007/BF00225739.

2. Byeon B., Kovalchuk I. Non-coding RNAs match the deleted genomic regions in humans. Sci. Rep. 2016;6:37452. DOI 10.1038/srep37452.

3. Chen G.Q. Effective reduction of chimeric tissue in transgenics for the stable genetic transformation of Lesquerella fendleri. HortScience. 2011;46:86-90. DOI 10.21273/HORTSCI.46.1.86.

4. Comai L., Cartwright R.A. A toxic mutator and selection alternative to the non-Mendelian RNA cache hypothesis for hothead reversion. Plant Cell. 2005;17:2856-2858. DOI 10.1105/tpc.105.036293.

5. Costa M.G.C., Otoni W.C., Moore G.A. An evaluation of factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of Citrus paradisi (Macf.) and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic genes. Plant Cell Rep. 2002;21:365-373. DOI 10.1007/s00299-002-0533-1.

6. Danilova S.A., Kusnetsov V.V., Dolgikh Yu.I. A novel efficient method for maize genetic transformation: usage of agrobacterial monolayer. Russ. J. Plant Physiol. 2009;56:258-263. DOI 10.1134/S1021443709020150.

7. Domínguez A., Cervera M., Pérez R.M., Romero J., Fagoaga C., Cubero J., López M.M., Juárez J.A., Navarro L., Peña L. Characterisation of regenerants obtained under selective conditions after Agrobacterium-mediated transformation of citrus explants reveals production of silenced and chimeric plants at unexpected high frequencies. Mol. Breed. 2004;14:171-183. DOI 10.1023/B:MOLB.0000038005.73265.61.

8. Faize M., Faize L., Burgos L. Using quantitative real-time PCR to detect chimeras in transgenic tobacco and apricot and to monitor their dissociation. BMC Biotechnol. 2010;10:53. DOI 10.1186/1472-6750-10-53.

9. Flachowsky H., Riedel M., Reim S., Hanke V. Evaluation of the uniformity and stability of T-DNA integration and gene expression in transgenic apple plants. Electron. J. Biotechnol. 2008;11(1):26-40. DOI 10.4067/S0717-34582008000100003.

10. Fulton T.M., Chunwongse J., Tanksley S.D. Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants. Plant Mol. Biol. Rep. 1995;13:207-209. DOI 10.1007/BF02670897.

11. Gomaa A.M., Raldugina G.N., Burmistrova N.A., Radionov N.V., Kuznetsov Vl.V. Response of transgenic rape plants bearing the OsMyb4 gene from rice encoding a trans-factor to low above-zero temperature. Russ. J. Plant Physiol. 2012;59(1):105-114. DOI 10.1134/S1021443711060070.

12. Green M.R., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th edn. 3 vol. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2013.

13. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 1994;6:271-282. DOI 10.1046/j.1365-313X.1994.6020271.x.

14. Hoang T.G., Raldugina G.N. Regeneration of transgenic plants expressing the g fp gene from rape cotyledonary and leaf explants: effects of the genotype and ABA. Russ. J. Plant Physiol. 2012;59(3): 406-412. DOI 10.1134/S1021443712030089.

15. Irish V.F. Cell lineage in plant development. Curr. Opin. Genet. Dev. 1991;1:169-173. DOI 10.1016/s0959-437x(05)80065-6.

16. Li B., Xie C., Qiu H. Production of selectable marker-free transgenic tobacco plants using a non-selection approach: chimerism or escape, transgene inheritance, and efficiency. Plant Cell Rep. 2009;28:373-386. DOI 10.1007/s00299-008-0640-8.

17. Lindblad K.A., Bracht J.R., Williams A.E., Landweber L.F. Thousands of RNA-cached copies of whole chromosomes are present in the ciliate Oxytricha during development. RNA. 2017;23(8):1200-1208. DOI 10.1261/rna.058511.116.

18. Lolle S.J., Victor J.L., Young J.M., Pruitt R.E. Genome wide non-Mendelian inheritance of extra-genomic information in Arabidopsis. Nature. 2005;434:505-509. DOI 10.1038/nature03380.

19. Malyshenko S.I., Tyul’kina L.G., Zvereva S.D., Raldugina G.N. Transgenic Brassica campestris plants expressing the gfp gene. Russ. J. Plant Physiol. 2003;50(2):276-281. DOI 10.1023/A:1022997803459.

20. Mercier R., Jolivet S., Vignard J., Durand S., Drouaud J., Pelletier G., Nogué F. Outcrossing as an explanation of the apparent unconventional genetic behavior of Arabidopsis thaliana hth mutants. Genetics. 2008;180:2295-2297. DOI 10.1534/genetics.108.095208.

21. Miyagawa Y., Ogawa J., Iwata Y., Koizumi N., Mishiba K.-I. An attempt to detect siRNA-mediated genomic DNA modification by artificially induced mismatch siRNA in Arabidopsis. PLoS One. 2013; 8(11):e81326. DOI 10.1371/journal.pone.0081326.

22. Popelka J.C., Stephanie G., Moore A., Molvig L., Higgins T.J.V. Genetic transformation of cowpea (Vigna unguiculata L.) and stable transmission of the transgenes to progeny. Plant Cell Rep. 2006;25: 304-312. DOI 10.1007/s00299-005-0053-x.

23. Qin Y., Gao L.H., Pulli S., Guo Y.D. Shoot differentiation, regeneration of cauliflower and analysis of somaclonal variation by RAPD. Hereditas. 2006;143:91-98. DOI 10.1111/j.2006.0018-0661.01944.x.

24. Rakosy-Tican E., Aurori C.M., Dijkstra C., Thieme R., Aurori A., Davey M.R. The usefulness of the g fp reporter gene for monitoring Agrobacterium-mediated transformation of potato dihaploid and tetraploid genotypes. Plant Cell Rep. 2007;26:661-671. DOI 10.1007/s00299-006-0273-8.

25. Raldugina G.N., Maree M., Mattana M., Shumkova G., Mapelli S., Kholodova V.P., Karpichev I.V., Kuznetsov Vl.V. Expression of rice OsMyb4 transcription factor improves tolerance to copper or zinc in canola plants. Biol. Plant. 2018;62:511-520. DOI 10.1007/s10535-018-0800-9.

26. Sarmah B.K., Moore A., Tate W., Molvig L., Morton R.L., Rees D.P., Higgins T.J.V. Transgenic chickpea seeds expressing high levels of a bean α-amylase inhibitor. Mol. Breed. 2004;14(1):73-82. DOI 10.1023/b:molb.0000037996.01494.12.

27. Schacherer J. Beyond the simplicity of Mendelian inheritance. C. R. Biologies. 2016;339(7-8):284-288. DOI 10.1016/j.crvi.2016.04.006.

28. Schmülling T., Schell J. Transgenic tobacco plants regenerated from leaf disks can be periclinal chimeras. Plant Mol. Biol. 1993;21:705-708. DOI 10.1007/BF00014554.

29. Sharma K.K., Thorpe T.A. In vitro regeneration of shoot buds and plantlets from seedling root segments of Brassica napus L. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1989;18:129-141. DOI 10.1007/BF00033471.

30. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 1962;59:223-239. DOI 10.1002/jcp.1030590302.

31. Smiryaev A.V., Kilchevsky A.V. Genetics of Populations and Quantitative Traits. Moscow: KolosS Publ., 2007. (in Russian)

32. Tizaoui K., Kchouk M.E. Genetic approaches for studying transgene inheritance and genetic recombination in three successive generations of transformed tobacco. Genet. Mol. Biol. 2012;35:640-649. DOI 10.1590/S1415-47572012000400015.

33. Tooke F., Battey N. Models of shoot apical meristem function. New Phytol. 2003;159:37-52. DOI 10.1046/j.1469-8137.2003.00803.x.

34. Walters D.A., Vetsch C.S., Potts D.E., Lundquist R.C. Transformation and inheritance of a hygromycin phosphotransferase gene in maize plants. Plant Mol. Biol. 1992;18:189-200. DOI 10.1007/BF00034948.

35. Yu U., Zhao Y.-Q., Zhao B., Ren S., Guo Y.-D. Influencing factors and structural characterization of hyperhydricity of in vitro regeneration in Brassica oleracea var. italica. Can. J. Plant Sci. 2011;91:159-165. DOI 10.1139/CJPS10034.

36. Zhu X.Y., Zhao M., Ma S., Ge Y.M., Zhang M.F., Chen L.P. Induction and origin of adventitious shoots from chimeras of Brassica juncea and Brassica oleracea. Plant Cell Rep. 2007;26:1727-1732. DOI 10.1007/s00299-007-0398-4.

37. Zvereva S.D., Romanov G.A. Reporter genes for plant genetic engineering: characteristics and detection. Russ. J. Plant Physiol. 2000; 47:424-432. Record Number: 20001614176.