Положительный опыт применения биобаллистического подхода к картофелю сортов Аксор и Невский

Метод биобаллистической трансформации растений – один из наиболее современных способов, используемых для прямого переноса генов в клетки растений. К главным преимуществам этого метода относятся возможность одновременно встраивать в геном растений несколько целевых генов, проводить перенос без лишних агробактериальных участков и последовательностей плазмидной ДНК, а также короткие сроки получения трансгенных клеток. В среднем для разных объектов эффективность получения трансгенных растений баллистическим методом варьирует от 1 до 3 %. Для растений картофеля на сегодняшний момент эффективность трансформации довольно низкая, и подбор оптимальных условий проведения биобаллистики является одним из актуальных вопросов практической биотехнологии. В данной статье представлен положительный опыт внедрения двух генов интереса в два сорта картофеля с использованием подходов биобаллистики. Представлены результаты экспериментов по биобаллистической трансформации двух видов эксплантов – междоузлий и каллусов картофеля сортов Аксор и Невский. Из 862 эксплантов, подвергнутых трансформации, получено 56 растений-регенерантов. В результате скрининга трансформантов методом ПЦР выявлено одно растение со вставкой гена хитиназы, одно со вставкой гена эндо-β-1,3-глюканазы и в четырех регенерантах подтверждена котрансформация обоими генами. Средняя эффективность трансформации эксплантов картофеля составила 0.7 %. Большое число растений-регенерантов (56) по отношению к числу трансформантов (6) отражает попытку увеличить количество регенерантов использованием низких концентраций селективного агента (антибиотика канамицина). Хотя этот подход требует заметных усилий, он может применяться для получения линий картофеля со вставкой генов интереса для их дальнейшего использования в селекции. Линии картофеля, полученные в данном исследовании после внедрения двух генов, связанных с устойчивостью растений к грибным патогенам, будут в дальнейшем оцениваться на устойчивость к грибным заболеваниям и в случае успешного прохождения испытаний будут включены в селекционный отбор.

1. Chirkin A.P., Zhidkeeva R.E., Ismagulova G.A. Cloning and analysis of basic class I chitinase and β-1,3-glucanase genes from potato induced by Fusarium solani infection. Izvestiya Natsyonalnoy Akademii Nauk Respubliki Kazakhstan = News of the National Academy of Sciences of the Republic of Kazakhstan. Series Biol. Med. 2016; 4(316):92-97. (in Russian)

2. Craig W., Gargano D., Scotti N., Nguyen T.T., Lao N.T., Kavanagh T.A., Dix P.J., Cardi T. Direct gene transfer in potato: a comparison of particle bombardment of leaf explants and PEG-mediated transformation of protoplasts. Plant Cell Rep. 2005;24(10):603-611. https://doi.org/10.1007/s00299-005-0018-0.

3. Ercolano M.R., Ballvora A., Paal J., Steinbiss H.H., Salamini F., Gebhardt C. Functional complementation analysis in potato via biolistic transformation with BAC large DNA fragments. Mol. Breed. 2004; 13(1):15-22. https://doi.org/10.1023/B:MOLB.0000012326.01128.5d.

4. Jo K.-R., Kim C.-J., Kim S.-J., Kim T.-Y., Bergervoet M., Jongsma M.A., Visser R.G.F., Jacobsen E., Vossen J.H. Development of late blight resistant potatoes by cisgene stacking. BMC Biotechnol. 2014;14(1):50. https://doi.org/10.1186/1472-6750-14-50.

5. Kisgyörgy B.N., Tamás C., Rákszegi M., Sági L., Láng L., Bedô Z. Regeneration ability of wheat (Triticum aestivum L.) embryos after bombardment with a particle gun. Acta Biol. Szeged. 2008;52(1): 127-130.

6. Mielby H., Sandoe P., Lassen J. The role of scientific knowledge in shaping public attitudes to GM technologies. Public Underst. Sci. Publ. online 2012. Publ. 2013;22(2):155-168. https://doi.org/10.1177/0963662511430577.

7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962;15(3): 473-497.

8. Nguyen T.T., Dix P.J., Nugent G.D. Transformation of potato via Agrobacterium coated microparticle bombardment. Biol. Plant. 2001; 54(1):141-144.

9. Rivera A.L., Gómez-Lim M., Fernández F., Loske A.M. Physical methods for genetic plant transformation. Phys. Life Rev. 2012;9(3): 308-345. https://doi.org/10.1016/j.plrev.2012.06.002.

10. Romano A., Raemakers K., Visser R., Mooibroek H. Transformation of potato (Solanum tuberosum) using particle bombardment. Plant Cell Rep. 2001;20(3):198-204. https://doi.org/10.1007/s002990000314.

11. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor; New York: Cold Spring Harbor laboratory, 1989.

12. Sanford B.J.C., Smith F.D., Russel J.A. Optimizing the biolictic process for different biological applications. Meth. Enzymol. 1993;217: 483-509.

13. Taylor N.J., Fauquet C.M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA Cell Biol. 2002; 21(12):963-977. https://doi.org/10.1089/104454902762053891.