Гипоморфная мутация гена Csn1s1 мыши, полученная пронуклеарной микроинъекцией CRISPR/Сas9

Казеины – это основные молочные белки, которые играют важную эволюционно консервативную роль в питании. Вариации последовательности казеиновых генов влияют на состав молока у животных. Регуляторные элементы казеиновых генов можно использовать для управления экспрессией желаемых трансгенов в молоке трансгенных животных. Десятки аллелей казеина идентифицированы у коз, коров, овец, верблюдов и лошадей, и эти варианты связаны с измененной экспрессией генов и содержанием молочного белка. Большинство известных мутаций, влияющих на экспрессию генов казеина, находится в промоторных и 3’-нетранслируемых областях. Мы выполнили пронуклеарные микроинъекции с мРНК Cas9 и sgRNA против первого кодирующего экзона гена Csn1s1 мыши, чтобы ввести случайные мутации в последовательность сигнального пептида α-казеина (Csn1s1) в начале гена мыши. Секвенирование мышей-основателей по Сэнгеру выявило 40 мутаций. Как и ожидалось, мутации группировались вокруг сайта разреза sgRNA (3 п.н. от PAM). Большинство мутаций представляют собой небольшие делеции (1–10 п.н.), но мы также обнаружили несколько более крупных делеций (100–300 п.н.). Функционально большинство мутаций приводило к нокаутам генов из-за сдвига рамки считывания или потери стартовых кодонов. Некоторые из мутаций представлены инделами в рамке считывания в первом кодирующем экзоне. Из них мы описываем новый гипоморфный аллель Csn1s1 (Csn1s1c.4-5insTCC). Мы измерили уровни белка Csn1s1 и подтвердили, что мутация отрицательно влияет на состав молока, который показывает снижение экспрессии гена на 50 % и уменьшение количества белка Csn1s1 на 40–80 % по сравнению с аллелем дикого типа. Мы предположили, что мутация влияет на стабильность транскрипта или сплайсинг по неизвестному механизму. Эта мутация потенциально может служить генетическим маркером низкой экспрессии Csn1s1.

1. An L.Y., Yuan Y.G., Yu B.L., Yang T.J., Cheng Y. Generation of human lactoferrin transgenic cloned goats using donor cells with dual markers and a modified selection procedure. Theriogenology. 2012; 78:1303-1311. DOI 10.1016/j.theriogenology.2012.05.027.

2. Burkov I.A., Serova I.A., Battulin N.R., Smirnov A.V., Babkin I.V., Andreeva L.E., Dvoryanchikov G.A., Serov O.L. Expression of the human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGMCSF) gene under control of the 5′-regulatory sequence of the goat alpha-S1-casein gene with and without a MAR element in transgenic mice. Transgenic Res. 2013;22:949-964. DOI 10.1007/s11248-013-9697-4.

3. Cartegni L., Chew S.L., Krainer A.R. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat. Rev. Genet. 2002;3(4):285-298. DOI 10.1038/nrg775. PMID 11967553.

4. Cieslak J., Wodas L., Borowska A., Pawlak P., Czyzak-Runowska G., Wojtowski J., Puppel K., Kuczynska B., Mackowski M. 5′-flanking variants of equine casein genes (CSN1S1, CSN1S2, CSN2, CSN3) and their relationship with gene expression and milk composition. J. Appl. Genet. 2019;60(1):71-78. DOI 10.1007/s13353-018-0473-2.

5. Dos Santos C.O., Dolzhenko E., Hodges E., Smith A.D., Hannon G.J. An epigenetic memory of pregnancy in the mouse mammary gland. Cell Rep. 2015;11:1102-1109. DOI 10.1016/j.celrep.2015.04.015.

6. Fomichev K.A., Sazanova A.L., Malewski T., Kaminski S., Sazanov A.A. Associations between two novel rSNPs in 5′-flanking region of the bovine casein gene cluster and milk performance traits. Gene. 2012;496:49-54. DOI 10.1016/j.gene.2011.12.038.

7. Guan D., Mármol-Sánchez E., Cardoso T.F., Such X., Landi V., Tawari N.R., Amills M. Genomic analysis of the origins of extant casein variation in goats. J. Dairy Sci. 2019;102:5230-5241. DOI 10.3168/jds.2018-15281.

8. Hogg D.R., Harries L.W. Human genetic variation and its effect on miRNA biogenesis, activity and function. Biochem. Soc. Trans. 2014; 42(4):1184-1189. DOI 10.1042/BST20140055. PMID 25110023.

9. Houdebine L.M. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2009;32:107-121. DOI 10.1016/j.cimid.2007.11.005.

10. Huang W., Peñagaricano F., Ahmad K.R., Lucey J.A., Weigel K.A., Khatib H. Association between milk protein gene variants and protein composition traits in dairy cattle. J. Dairy Sci. 2012;95:440-449. DOI 10.3168/jds.2011-4757.

11. Kalds P., Zhou S., Cai B., Liu J., Wang Y., Petersen B., Sonstegard T., Wang X., Chen Y. Sheep and goat genome engineering: from random transgenesis to the CRISPR Era. Front. Genet. 2019;10:750. DOI 10.3389/fgene.2019.00750. eCollection2019.

12. Kim J.J., Yu J., Bag J., Bakovic M., Cant J.P. Translation attenuation via 3′ terminal codon usage in bovine csn1s2 is responsible for the difference in αs2- and β-casein profile in milk. RNA Biol. 2015;12: 354-367. DOI 10.1080/15476286.2015.1017231.

13. Kolb A.F., Huber R.C., Lillico S.G., Carlisle A., Robinson C.J., Neil C., Petrie L., Sorensen D.B., Olsson I.A., Whitelaw C.B. Milk lacking α-casein leads to permanent reduction in body size in mice. PLoS One. 2011;6:e21775. DOI 10.1371/journal.pone.0021775.

14. Lee H.K., Willi M., Wang C., Yang C.M., Smith H.E., Liu C., Hennighausen L. Functional assessment of CTCF sites at cytokinesensing mammary enhancers using CRISPR/Cas9 gene editing in mice. Nucleic Acids Res. 2017;45:4606-4618. DOI 10.1093/nar/gkx185.

15. Li W.R., Liu C.X., Zhang X.M., Chen L., Peng X.R., He S.G., Lin J.P., Han B., Wang L.Q., Huang J.C., Liu M.J. CRISPR/Cas9-mediated loss of FGF5 function increases wool staple length in sheep. FEBS J. 2017;284:2764-2773. DOI 10.1111/febs.14144.

16. Lindeboom R.G.H., Vermeulen M., Lehner B., Supek F. The impact of nonsense-mediated mRNA decay on genetic disease, gene editing and cancer immunotherapy. Nat. Genet. 2019;51(11):1645- 1651. DOI 10.1038/s41588-019-0517-5. Epub 2019 Oct 28. PMID 31659324. PMCID PMC6858879.

17. Liu H.C., Pai S.Y., Chen H.L., Lai C.W., Tsai T.C., Cheng W.T., Yang S.H., Chen C.M. Recombinant Derp5 allergen with αS1-casein signal peptide secreted in murine milk protects against dust mite allergen-induced airway inflammation. J. Dairy Sci. 2014;97:6792- 6803. DOI 10.3168/jds.2014-8484.

18. Lu R., Zhang T., Song S., Zhou M., Jiang L., He Z., Yuan Y., Yuan T., Lu Y., Yan K., Cheng Y. Accurately cleavable goat β-lactoglobulin signal peptide efficiently guided translation of a recombinant human plasminogen activator in transgenic rabbit mammary gland. Biosci. Rep. 2019;39:6. DOI 10.1042/BSR20190596.

19. Mucaki E.J., Shirley B.C., Rogan P.K. Expression changes confirm genomic variants predicted to result in allele-specific, alternative mRNA splicing. Front. Genet. 2020;11:109. DOI 10.3389/fgene.2020.00109. PMID 32211018. PMCID PMC7066660.

20. Noce A., Pazzola M., Dettori M.L., Amills M., Castelló A., Cecchinato A., Bittante G., Vacca G.M. Variations at regulatory regions of the milk protein genes are associated with milk traits and coagulation properties in the Sarda sheep. Anim. Genet. 2016;47:717-726. DOI 10.1111/age.12474.

21. Park K.E., Powell A., Sandmaier S.E., Kim C.M., Mileham A., Donovan D.M., Telugu B.P. Targeted gene knock-in by CRISPR/Cas ribonucleoproteins in porcine zygotes. Sci. Rep. 2017;7:42458. DOI 10.1038/srep42458.

22. Popp M.W., Maquat L.E. Leveraging rules of nonsense-mediated mRNA decay for genome engineering and personalized medicine. Cell. 2016;165(6):1319-1322. DOI 10.1016/j.cell.2016.05.053. PMID 27259145. PMCID PMC4924582.

23. Qian X., Kraft J., Ni Y., Zhao F.Q. Production of recombinant human proinsulin in the milk of transgenic mice. Sci. Rep. 2014;4:6465. DOI 10.1038/srep06465.

24. Rijnkels M., Elnitski L., Miller W., Rosen J.M. Multispecies comparative analysis of a mammalian-specific genomic domain encoding secretory proteins. Genomics. 2003;82:417-432. DOI 10.1016/s0888-7543(03)00114-9.

25. Rijnkels M., Freeman-Zadrowski C., Hernandez J., Potluri V., Wang L., Li W., Lemay D.G. Epigenetic modifications unlock the milk protein gene loci during mouse mammary gland development and differentiation. PLoS One. 2013;8:e53270. DOI 10.1371/journal.pone.0053270.

26. Sanchez M.P., Wolf V., El Jabri M., Beuvier E., Rolet-Répécaud O., Gaüzère Y., Minéry S., Brochard M., Michenet A., Taussat S., Barbat-Leterrier A., Delacroix-Buchet A., Laithier C., Fritz S., Boichard D. Short communication: Confirmation of candidate causative variants on milk composition and cheesemaking properties in Montbéliarde cows. J. Dairy Sci. 2018;101:10076-10081. DOI 10.3168/jds.2018-14986.

27. Sterne-Weiler T., Sanford J.R. Exon identity crisis: disease-causing mutations that disrupt the splicing code. Genome Biol. 2014;15(1):201. DOI 10.1186/gb4150. PMID 24456648. PMCID PMC4053859.

28. Thompson B.A., Walters R., Parsons M.T., Dumenil T., Drost M., Tiersma Y., Lindor N.M., Tavtigian S.V., de Wind N., Spurdle A.B., InSiGHT Variant Interpretation Committee. Contribution of mRNA splicing to mismatch repair gene sequence variant interpretation. Front. Genet. 2020;11:798. DOI 10.3389/fgene.2020.00798. PMID 32849802. PMCID PMC7398121.

29. Tuladhar R., Yeu Y., Tyler Piazza J., Tan Z., Rene Clemenceau J., Wu X., Barrett Q., Herbert J., Mathews D.H., Kim J., Hyun Hwang T., Lum L. CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation. Nat. Commun. 2019;10(1):4056. DOI 10.1038/s41467-019-12028-5. PMID 31492834. PMCID PMC6731291.

30. Uusi-Oukari M., Hyttinen J.M., Korhonen V.P., Västi A., Alhonen L., Jänne O.A., Jänne J. Bovine alpha s1-casein gene sequences direct high level expression of human granulocyte-macrophage colonystimulating factor in the milk of transgenic mice. Transgenic Res. 1997;6:75-84. DOI 10.1023/a:1018461201385.

31. Wan Y.J., Zhang Y.L., Zhou Z.R., Jia R.X., Li M., Song H., Wang H.Z., Wang L.Z., Zhang G.M., You J.H., Wang F. Efficiency of donor cell preparation and recipient oocyte source for production of transgenic cloned dairy goats harboring human lactoferrin. Theriogenology. 2012;78:583-592. DOI 10.1016/j.theriogenology.2012.03.004.

32. Wang K., Yan H., Xu H., Yang Q., Zhang S., Pan C., Chen H., Zhu H., Liu J., Qu L., Lan X. A novel indel within goat casein alpha S1 gene is significantly associated with litter size. Gene. 2018;671:161-169. DOI 10.1016/j.gene.2018.05.119.

33. Wu X., Lin Y., Xiong F., Zhou Y., Yu F., Deng J., Huang P., Chen H. The extremely high level expression of human serum albumin in the milk of transgenic mice. Transgenic Res. 2012;21:1359-1366. DOI 10.1007/s11248-012-9612-4.

34. Yamaji D., Kang K., Robinson G.W., Hennighausen L. Sequential activation of genetic programs in mouse mammary epithelium during pregnancy depends on STAT5A/B concentration. Nucleic Acids Res. 2013;41:1622-1636. DOI 10.1093/nar/gks1310.

35. Yu Z., Meng Q., Yu H., Fan B., Yu S., Fei J., Wang L., Dai Y., Li N. Expression and bioactivity of recombinant human lysozyme in the milk of transgenic mice. J. Dairy Sci. 2006;89:2911-2918. DOI 10.3168/jds.S0022-0302(06)72563-2.

36. Yuan Y.G., An L., Yu B., Song S., Zhou F., Zhang L., Gu Y., Yu M., Cheng Y. Expression of recombinant human alpha-lactalbumin in the milk of transgenic goats using a hybrid pomoter/enhancer. J. Anal. Method. Chem. 2014;281031. DOI 10.1155/2014/281031.

37. Yue X.P., Zhang X.M., Wang W., Ma R.N., Deng C.J., Lan X.Y., Chen H., Li F., Xu X.R., Ma Y., Lei C.Z. The CSN1S1 N and F alleles identified by PCR-SSCP and their associations with milk yield and composition in Chinese dairy goats. Mol. Biol. Rep. 2011;38: 2821-2825. DOI 10.1007/s11033-010-0428-0.

38. Zhou S., Cai B., He C., Wang Y., Ding Q., Liu J., Liu Y., Ding Y., Zhao X., Li G., Li C., Yu H., Kou Q., Niu W., Petersen B., Sonstegard T., Ma B., Chen Y., Wang X. Programmable base editing of the sheep genome revealed no genome-wide off-target mutations. Front. Genet. 2019;10:215. DOI 10.3389/fgene.2019.00215.