Экспрессию эукариотических генов можно регулировать на нескольких этапах, включая трансляцию мРНК. Известно, что структура мРНК способна влиять как на эффективность взаимодействия с аппаратом трансляции в целом, так и на выбор сайтов инициации трансляции. Для исследования транслируемой фракции транскриптома были разработаны экспериментальные методы анализа, наиболее информативным из которых является рибосомное профилирование (РП, Ribo-seq). Первоначально созданный для использования в дрожжевых системах, этот метод был адаптирован для трансляционных исследований на многих видах растений. Технология включает выделение полисомной фракции и высокопроизводительное секвенирование пула сегментов мРНК, связанных с рибосомами. Сравнение результатов покрытия транскриптома прочтениями, полученными по протоколу рибосомного профилирования, с аналогичным результатами по секвенированию транскриптома дает возможность оценить эффективность трансляции для каждого транскрипта. Точные положения рибосом, определенные на последовательностях мРНК, позволяют определять трансляцию открытых рамок считывания и переключение между трансляцией нескольких рамок считывания – феномен, при котором с одной матрицы РНК происходят считывание двух или более перекрывающихся рамок и биосинтез разных белков. Преимущество метода заключается в том, что он дает возможность получить количественные оценки покрытия рибосомами мРНК и может выявлять относительно редкие события трансляции. Использование этой технологии позволило классифицировать гены растений по типу регуляции их экспрессии на уровне транскрипции, трансляции или на обоих уровнях. Обнаружены особенности структуры мРНК, которые влияют на уровни трансляции: формирование квадруплексов G2 и наличие специфических мотивов в области 5’-UTR, GC-состав, наличие альтернативных стартов трансляции, влияние uORF на трансляцию нижестоящих mORF. Показано, что изменения регуляции экспрессии генов на уровне трансляции возникают в ответ на биотический и абиотический стрессы, а также в процессе развития растений. В обзоре кратко рассмотрены методология РП и перспективы ее применения для исследования структурно-функциональной организации и регуляции экспрессии генов растений.

В отделе генетических ресурсов пшеницы ВНИИ генетических ресурсов растений (ВИР) разработана и в 1979 г. опубликована система рода Triticum L., базирующаяся на учете геномного состава видов и наличии или отсутствии у них ряда главных генов, контролирующих «классификационные» признаки. Она основана на исследованиях F. Körnicke и J. Percival, дополненных Н.И. Вавиловым и К.А. Фляксбергером. Эту систему, известную как “Classification of Triticum by Dorofeev et al.”, относят к ряду основных современных классификаций рода. Это первая в мире стандартизированная система, содержащая все известные внутривидовые (инфраспецифические) таксоны диких и культурных видов пшеницы. Она дает возможность идентификации большого разнообразия форм при работе с родом Triticum L. и отдельными его видами, что особенно важно для коллекций, сохраняемых в генетических банках семян. Применение внутривидовой классификации рода Triticum L. для идентификации образцов коллекции ВИР, интродуцированных из различных источников или поступивших после полевого размножения для пополнения репродукции образцов, значительно упрощает этот процесс. Однако прямое использование такой объемной классификации связано с рядом трудностей. Поэтому нами предлагается унифицированная внутривидовая классификация твердой пшеницы лишь 16 из 131 разновидности, описанной к настоящему времени, которые обладают наиболее часто встречающимися в коллекциях твердой пшеницы комплексами морфологических признаков колоса и зерновки. Остальные 115 разновидностей, имеющих дополнительные признаки, получают свое название путем добавления к основному названию сокращенного латинского названия того или иного дополнительного признака. Владение таким способом описания морфологических признаков образцов может помочь любому пользователю легко ориентироваться в систематизированном внутривидовом разнообразии коллекций. Цель данной статьи – познакомить читателя с внутривидовой классификацией твердой пшеницы (Triticum durum Desf.), разработанной в ВИР, и предложить ее упрощенный вариант, построенный на выделении главных и дополнительных морфологических признаков колоса и зерновки.

Вироиды, небольшие кольцевые молекулы РНК, которые вызывают патогенез у растений, остаются одним из самых необычных биологических объектов, привлекающих внимание не только фитопатологов, но и специалистов в области молекулярной эволюции. В статье приведен обзор последних литературных данных о генетике вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) и генетических механизмах формирования патологических состояний у растений-хозяев. ВВКК способен передаваться вертикально (через генеративные клетки зараженного растения), но, в отличие от некоторых других вироидов, не передается через пыльцу от зараженного растения. Большой интерес у исследователей вызывает структура геномной РНК вироида размером 359 нуклеотидов: хорошо известно, что особенности 3D конформации определяют основные параметры взаимодействия с клеточными факторами на стадии репликации, транспорта между различными тканями в процессе системной инфекции, а также степень выраженности симптомов заболевания. При репликации геномной РНК вироидов часто происходят ошибки, приводящие к появлению гетерогенной популяции молекул РНК в тканях зараженного растения. Примечательно, что через 7 дней после инокуляции только 25 % молекул геномной РНК ВВКК соответствовали исходной матрице, использованной для инокуляции, однако эта доля увеличилась до 70 % через 14 дней и далее оставалась на том же уровне. По-видимому, при сохранении у мутантных вариантов геномной РНК способности к репликации вироид обладает высоким потенциалом к отбору эффективных инфекционных форм. ВВКК вызывает у пораженных растений развитие иммунного ответа, механизмы индукции которого недостаточно изучены. Известны сильно- и слабопатогенные штаммы ВВКК, вызывающие разные проявления болезни, фенотипические проявления от которых у пораженных растений в значительной мере различны. Сама по себе репликация вироида не обязательно приводит к выраженным фенотипическим проявлениям, в случае ВВКК они могут быть связаны с участками гомологии между геномной РНК и мРНК некоторых регуляторных генов, например транскрипционного фактора StTCP23 картофеля, участвующего в регуляторном контуре гиббереллиновой кислоты и в контроле морфогенеза клубня. Другой пример – индукция РНК-интерференции против мРНК гена FRIGIDA-like protein 3 у томата, что приводит к раннему цветению. В связи с этим обсуждаются потенциальные способы борьбы с вироидом, основанные на удалении из генома растений таких участков гомологии, расположенных в нетранслируемых областях мРНК и не выполняющих каких-либо функций. В целом вироиды представляют собой уникальную модель для исследования основ организации живых систем, многие из которых возникли на ранних этапах эволюции и остаются до сих пор не выявленными.

Производство удвоенных гаплоидов in vitro – актуальный биотехнологический способ ускоренного создания родительских линий для селекции гибридов F1. В отличие от классического инбридинга время создания гомозиготных линий свеклы (Beta vulgaris) с помощью технологии удвоенных гаплоидов сокращается с пяти–шести до двух поколений. Гиногенез является наиболее распространенным биотехнологическим методом производства удвоенных гаплоидов сахарной и столовой свеклы. Протоколы производства удвоенных гаплоидов для видов B. vulgaris немногочисленны и разработаны в основном для сахарной свеклы (B. vulgaris convar. saccharifera Alef.). Наибольший успех достигнут в производстве удвоенных гаплоидов сахарной свеклы гиногенезом в культуре изолированных семязачатков. Для столовой свеклы (B. vulgaris convar. esculenta Salisb.) проведены единичные исследования с показанной низкой эффективностью производства гаплоидных растений андро- и гиногенезом. В итоге протоколы производства удвоенных гаплоидов столовой свеклы отсутствуют, а протоколы, разработанные для сахарной свеклы, неэффективны для столовой, несмотря на принадлежность к одному виду. Исследования производства удвоенных гаплоидов путем андрогенеза у представителей рода Beta активно проводились в 70–80-х гг. прошлого столетия и не закончились получением растений-регенерантов, однако в настоящее время среди ученых снова возник интерес к данному методу и в разных странах возобновлены работы по изучению андрогенеза у представителей рода Beta. Статья содержит обзор исследований, посвященных созданию удвоенных гаплоидов; обсуждение подходов решения основных проблем при получении удвоенных гаплоидов и методов, позволяющих повысить выход эмбриоидов и растений-регенерантов, а также удвоенных гаплоидов у растений вида B. vulgaris.

В статье представлен обзор проблем разведения и селекции лабораторных мини-свиней. Наиболее очевидные из них – отсутствие централизованного учета селекционных групп, единых стандартов отбора для воспроизводства и оценки племенных животных, а также минимизация накопления снижающих приспособленность мутаций и поддержание генетического разнообразия. По последним данным, в мире насчитывают не менее 30 селекционных групп мини-свиней, систематически используемых в качестве лабораторных животных. Среди них существуют как породные образования, представленные несколькими колониями, так и селекционные группы, состоящие из одного стада. Показано, что основная стратегия отбора включает селекцию на живую массу взрослых особей 50–80 кг и приспособленность животных к конкретному типу биомедицинских экспериментов. Для ее реализации в разведении зарубежных мини-свиней практикуют отбор по живой массе в 140- и 154-дневном возрасте. Указано, что в стадах мини-свиней представлены разные селекционные методы противодействия инбредной депрессии и поддержания генетического разнообразия. Примерами служат максимизация фенотипов масти, цикличная система подбора родительских пар и структурирование стад на субпопуляции. Кроме того, в разведении зарубежных мини-свиней для мониторинга гетерозиготности используют молекулярно-генетические методы. Количество инбредных скрещиваний в разведении лабораторных мини-свиней стараются минимизировать, что не всегда возможно из-за их малочисленности. Подсчитано, что во избежание тесного инбридинга численность селекционной группы должна быть не менее 28 особей, включающих хряков как минимум четырех генеалогических линий и свиноматок из не менее четырех семейств. Накопление генетического груза в стадах мини-свиней возможно, но вредоносный эффект является скорее следствием ошибочных решений селекционеров. Несмотря на то что при выведении ряда мини-свиней стояла цель укомплектовать стада исключительно белыми животными, в большинстве селекционных групп наблюдается полиморфизм по фенотипу масти.

Белок дрозофилы GAGA (GAF) является фактором эпигенетической регуляции транскрипции большой группы генов с широким разнообразием клеточных функций. GAF кодируется геном Trithorax-like (Trl), который экспрессируется в различных органах и тканях на всех стадиях онтогенеза дрозофилы. Мутации этого гена вызывают множественные нарушения развития. В предыдущих работах мы показали, что этот белок необходим для развития половой системы как самцов, так и самок дрозофилы. Снижение экспрессии гена Trl приводило ко множественным нарушениям спермато- и оогенеза. Одно из значительных нарушений было связано с массовой деградацией и потерей клеток зародышевого пути, что позволило предположить, что этот белок вовлечен в регуляцию клеточной гибели. В представленной работе мы провели более детальное цитологическое исследование, чтобы определить, какой тип гибели клеток зародышевого пути характерен для Trl-мутантов, и происходят ли нарушения или изменения этого процесса по сравнению с нормой. Полученные результаты показали, что недостаток белка GAF вызывает массовую гибель клеток зародышевого пути как у самок, так и самцов дрозофилы, но проявляется эта гибель в зависимости от пола по-разному. У самок, мутантных по гену Trl, фенотипически этот процесс не отличается от нормы и в гибнущих яйцевых камерах выявлены признаки апоптоза и аутофагии клеток зародышевого пути. У самцов, мутантных по гену Trl, в отличие от самок, не обнаружены признаки апоптоза. У самцов мутации Trl индуцируют массовую гибель клеток через аутофагию, что не характерно для сперматогенеза дрозофилы и не описано ранее ни в норме, ни у мутаций по другим генам. Таким образом, недостаток GAF у мутантов Trl приводит к усилению апоптотической и аутофагической гибели клеток зародышевого пути. Эктопическая клеточная гибель и атрофия зародышевой линии, вероятно, связаны с нарушением экспрессии генов-мишеней GAGAфактора, среди которых есть гены, регулирующие как апоптоз, так и аутофагию.

Врожденный иммунитет первым отвечает на инфекцию. Он участвует в распознавании патогена, привлечении к месту заражения иммунных клеток, а также активирует адаптивный иммунитет и регулирует интенсивность воспалительного ответа. Для двух однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов врожденного иммунитета – rs5743708 (Arg753Gln) гена TLR2 и rs8177374 (Ser180Leu) гена TIRAP – была показана ассоциация одновременно с пневмонией и туберкулезом, однако полученные данные различаются для разных этнических групп. Для rs10902158, расположенного в генетическом локусе PKP3-SIGGIR-TMEM16J, ранее было показано, что он входит в гаплотип, расоспецифически ассоциированный с туберкулезом. При этом на тер ритории Азии наблюдается градиент его частоты. Целью нашей работы была оценка влияния отбора по генотипам названных ОНП на генофонды популяций, живущих в климатических условиях, неблагоприятных по инфекционным заболеваниям легких. Мы оценили распространение этих ОНП в выборках европеоидного и монголоидного (чукчи и якуты) населения Северной Азии и среди пациентов с внебольничной пневмонией. Носительство аллеля А rs5743708 гена TLR2 предрасполагало к развитию тяжелой внебольничной пневмонии (OR = 2.77, p = 0.021), а генотип GG/CT по rs5743708/rs8177374 оказался протективным против нее (OR = 0.478, p = 0.022) у европеоидов. Ассоциации rs10902158 с внебольничной пневмонией (как в целом, так и ее тяжелой формы) в европеоидной выборке обнаружено не было. Дифференцировка внебольничных пневмоний по их этиологии, возможно, позволит устранить наблюдаемые противоречия в данных разных исследователей об ассоциации исследованных ОНП с заболеванием. Не выявлено достоверных различий по частоте rs5743708 гена TLR2 и rs8177374 гена TIRAP между европеоидными выборками подростков и долгожителей. Вероятно, эти ОНП не влияют на предрасположенность к долгожительству в европеоидных популяциях, проживающих на Севере Евразии. Исследованные нами европеоидные и монголоидные популяционные выборки отличались по частотам вышеперечисленных вариантов от западноевропейских и восточноазиатских популяций. Частота варианта rs8177374 T (Ser180Leu) гена TIRAP в выборке чукчей была достоверно выше (p = 0, χ² = 63.22), чем в популяциях Восточной Азии, что может служить подтверждением нашего предположения об отборе этого варианта в ходе миграции человека в районы с неблагоприятными климатическими условиями.

Пребывание человека и животных в условиях длительного непрерывного освещения приводит к подавлению синтеза мелатонина, т. е. к светоиндуцированной функциональной эпифизэктомии (СФЭ), и развитию десинхроноза. Для создания СФЭ мыши линии С57Bl/6 содержались в условиях круглосуточного освещения в течение 14 суток. Животные контрольной группы находились при стандартном режиме освещения. В следующей серии экспериментов мыши с СФЭ получали ежедневно внутрижелудочно либо мелатонин (1 мг/кг массы тела в 200 мкл воды), либо в качестве плацебо 200 мкл дистиллированной воды. Группой сравнения служили интактные животные, получавшие плацебо при стандартном режиме освещения. В результате иммуногистохимического анализа (непрямым авидин-биотиновым пероксидазным методом) в си нусоидных клетках печени (гетерогенная популяция, состоящая из эндотелиоцитов, клеток Купфера, клеток Ито и pit-клеток) и в отдельных гепатоцитах была выявлена экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 и проапоптотического протеина Bad. В клетках печени мышей с моделью СФЭ обнаружено четырехкратное увеличение площади экспрессии Bad на фоне неизменившейся площади экспрессии Bcl-2. Достоверных изменений яркости (параметр, обратно пропорциональный концентрации маркера) участков, окрашенных на Bcl-2 и Bad, отмечено не было. Полученные данные свидетельствуют об ослаблении антиапоптотической защиты клеток печени животных, содержавшихся при круглосуточном освещении, что создает условия для активации «митохондриальной ветви» апоптоза, наиболее выраженной в синусоидных клетках печени. Введение мелатонина мышам с моделью СФЭ привело к возрастанию в 3.3 раза площади экспрессии Bcl-2 и снижению на 2.7 % яркости (т.е. увеличению концентрации) участков, окрашенных на Bcl-2, по сравнению с опытной группой без лечения. Для Bad изменения исследуемых параметров имели характер тенденций. Таким образом, интрагастральное введение мелатонина животным аннулирует эффект светоиндуцированной функциональной пинеалэктомии, восстанавливая площадь экспрессии и увеличивая концентрацию антиапоптотического белка Bcl-2 в клетках печени, что свидетельствует об усилении антиапоптотической защиты клеток органа и создает условия для блокирования развития «митохондриальной ветви» апоптоза.

Многие процессы в живых организмах подвержены периодическим колебаниям на различных иерархических уровнях их организации: от молекулярного-генетического до популяционного и экологического. Осциллирующие процессы отвечают за клеточные циклы как у прокариот, так и у эукариот, за циркадные ритмы, синхронную связь дыхания с сердечными сокращениями и др. Колебания численностей организмов в природных популяциях могут быть обусловлены собственными свойствами популяций, их возрастной структурой, а также экологическими взаимоотношениями с другими видами. Наряду с экспериментальными подходами, для исследования осциллирующих биологических систем широко применяется математическое и компьютерное моделирование. В данной статье представлены классические математические модели, которые описывают осциллирующее поведение в биологических системах. Приведены методы поиска осциллирующих молекулярно-генетических систем на примере их частного случая – осциллирующих ферментативных систем. Рассмотрены факторы, влияющие на циклическую динамику в живых системах, характерные не только для молекулярно-генетического уровня, но и для более высоких уровней организации. Обсуждается применение различных способов описания генных сетей для моделирования осциллирующих молекулярно-генетических систем, где важнейшим фактором возникновения циклического поведения является наличие обратных связей. Представлены технологии поиска потенциально осциллирующих ферментативных систем. С помощью метода, описанного в статье, проводится поэтапный процесс построения и анализа сначала структурных моделей (графов) генных сетей, а затем реконструкции математических моделей и вычислительных экспериментов с ними. Структурные модели идеально подходят для задач автоматического поиска потенциальных осциллирующих контуров (связных подграфов), структура которых может соответствовать математической модели молекулярно-генетической системы, демонстрирующей осциллирующее поведение в динамике. При этом именно численное исследование математических моделей для отобранных контуров позволяет подтвердить наличие в них устойчивых предельных циклов. В качестве примера применения технологии проанализирована сеть из 300 метаболических реакций бактерии Escherichia coli с использованием инструментов математического и компьютерного моделирования. В частности, показано осциллирующее поведение для контура, реакции которого входят в путь биосинтеза триптофана.

Казеины – это основные молочные белки, которые играют важную эволюционно консервативную роль в питании. Вариации последовательности казеиновых генов влияют на состав молока у животных. Регуляторные элементы казеиновых генов можно использовать для управления экспрессией желаемых трансгенов в молоке трансгенных животных. Десятки аллелей казеина идентифицированы у коз, коров, овец, верблюдов и лошадей, и эти варианты связаны с измененной экспрессией генов и содержанием молочного белка. Большинство известных мутаций, влияющих на экспрессию генов казеина, находится в промоторных и 3’-нетранслируемых областях. Мы выполнили пронуклеарные микроинъекции с мРНК Cas9 и sgRNA против первого кодирующего экзона гена Csn1s1 мыши, чтобы ввести случайные мутации в последовательность сигнального пептида α-казеина (Csn1s1) в начале гена мыши. Секвенирование мышей-основателей по Сэнгеру выявило 40 мутаций. Как и ожидалось, мутации группировались вокруг сайта разреза sgRNA (3 п.н. от PAM). Большинство мутаций представляют собой небольшие делеции (1–10 п.н.), но мы также обнаружили несколько более крупных делеций (100–300 п.н.). Функционально большинство мутаций приводило к нокаутам генов из-за сдвига рамки считывания или потери стартовых кодонов. Некоторые из мутаций представлены инделами в рамке считывания в первом кодирующем экзоне. Из них мы описываем новый гипоморфный аллель Csn1s1 (Csn1s1c.4-5insTCC). Мы измерили уровни белка Csn1s1 и подтвердили, что мутация отрицательно влияет на состав молока, который показывает снижение экспрессии гена на 50 % и уменьшение количества белка Csn1s1 на 40–80 % по сравнению с аллелем дикого типа. Мы предположили, что мутация влияет на стабильность транскрипта или сплайсинг по неизвестному механизму. Эта мутация потенциально может служить генетическим маркером низкой экспрессии Csn1s1.

Нематоды относятся к числу значимых вредителей сельскохозяйственных растений. В обзоре рассмотрены последние данные о молекулярных механизмах устойчивости растений к цистообразующим и галловым нематодам, среди которых одни из наиболее вредоносных видов: Globodera rostochiensis, G. pallida, Heterodera schachtii, Meloidogyne chitwoodi и M. incognita. Например, золотистая картофельная нематода G. rostochiensis, зарегистрированная в 61 субъекте РФ на общей площади 1.8 млн га, способна приводить к потере от 19 до 90 % урожая картофеля. Биологические особенности нематод затрудняют разработку агротехнических способов борьбы с ними: цисты G. rostochiensis сохраняют жизнеспособность в почве в течение многих лет, нематициды токсичны или малоэффективны, поэтому предпочтительным методом борьбы с ними является интрогрессия генов устойчивости от родственных культурных и дикорастущих видов. Стратегия жизненного цикла цистообразующих и галловых нематод основана на способности личинок проникать в корни восприимчивых видов растений, репрограммировать клетки растения-хозяина, формирующие гигантские клетки или синцитии в качестве питающих структур, а также ингибировать иммунный ответ. Молекулярные механизмы, лежащие в основе такого взаимодействия в системе «патоген–хозяин», вызывают значительный интерес как с точки зрения управления морфогенезом растений, так и в аспекте разработки безопасных и эффективных способов борьбы с паразитическими нематодами. В обзоре рассмотрены данные об эффекторах, с помощью которых разные виды нематод контролируют иммунный ответ растения-хозяина, а также гены устойчивости (R-гены) и некоторые молекулярные механизмы, прерывающие формирование питающих структур и развитие паразита. Приведены новые данные о способах генетического контроля, основанных на одном из активно обсуждаемых в последнее время варианте механизма РНК-интерференции – HIGS (host induced gene silencing), представляющем собой адресное выключение экспрессии гена-мишени в клетках личинки нематоды с помощью специфических двуцепочечных РНК, синтезирующихся в клетках растения-хозяина. Индукция РНК-интерференции в клетках растений приводит к появлению молекул-медиаторов, способных инициировать аналогичный процесс в клетках фитофагов, взаимодействующих с растением, в том числе у личинок нематод. Описаны случаи, в которых такое адресное выключение экспрессии генов-мишеней приводило к нарушениям развития личинок и высокому уровню защиты сельскохозяйственных растений от наиболее опасных видов нематод.

Корректное развертывание генетических программ развития и дифференцировки опирается на тонко координированную регуляцию экспрессии специфических наборов генов. Исключительную роль в управлении этим процессом играют регуляторные элементы генома, к которым относятся промоторы, энхансеры, инсуляторы и сайленсеры. Нарушения в их работе могут приводить к развитию различных патологий, включая онкологические заболевания, пороки развития и аутоиммунные заболевания. Развитие технологий высокопроизводительного геномного анализа позволило значительно ускорить накопление информации о специфичных эпигенетических характеристиках регуляторных элементов. В совокупности с полногеномными исследованиями распределения эпигенетических меток, регуляторных белков и пространственной структуры хроматина такие данные значительно расширяют представления о принципах эпигенетической регуляции генов и позволяют осуществлять поиск потенциальных регуляторных элементов in silico. Вместе с тем основные экспериментальные подходы, используемые для исследования локальных характеристик хроматина, имеют ряд технических ограничений, которые снижают достоверность биоинформатической идентификации регуляторных областей генома. В связи с этим, а также с учетом вариабельности функций эпигенетических детерминант и многокомпонентной регуляции работы элементов генома определение их регуляторной роли часто требует функциональной проверки. Разработано множество методов, позволяющих провести исследование функциональной роли регуляторных элементов в масштабе генома. В настоящем обзоре кратко описаны основные экспериментальные подходы для проведения идентификации регуляторных элементов in silico и присущие им технические ограничения. Рассмотрены оригинальные методы высокопроизводительного репортерного анализа активности энхансеров, которые используют для валидации предсказанных регуляторных элементов и de novo поиска. Описанные методы анализа дают возможность оценить функциональную роль нуклеотидной последовательности регуляторного элемента, определить его точные границы, а также оценить влияние локального состояния хроматина на активность энхансеров и экспрессию генов. Применение таких методологических подходов обеспечило значительный вклад в понимание фундаментальных принципов регуляции генной экспрессии.