CLARITY и Light-Sheet микроскопия применительно к органоидам головного мозга человека

Церебральные органоиды – это трехмерные системы культивирования клеток, представляющие собой уникальную экспериментальную модель, которая позволяет реконструировать ранние события нейрогенеза человека in vitro в норме и при различных патологиях. На сегодняшний день для изучения морфологических параметров органоидов чаще всего применяют иммуногистохимический анализ. В связи с этим аспекты трехмерной цитоархитектуры органоидов, такие как нейронные сети или асимметричная внутренняя организация, трудно реконструировать при использовании рутинных подходов. Иммуногистохимический анализ биологических объектов является универсальным методом в биологических исследованиях. Один из ключевых этапов данного подхода – изготовление крио- или парафиновых серийных срезов образцов. Это очень трудоемкий и времязатратный процесс. Кроме того, срезы представляют собой лишь небольшую часть исследуемого объекта, а трехмерная реконструкция из полученных серийных изображений является крайне сложной процедурой и часто требует специальных дорогостоящих программ для обработки изображений. К сожалению, окрашивание и микроскопирование целых образцов затруднено из-за их низкой проницаемости и высокого уровня автофлуоресценции. Технологии очистки тканей в сочетании с Light-Sheet микроскопией дают возможность преодолеть эти проблемы при работе. CLARITY – это одна из технологий подготовки тканей, позволяющая сделать непрозрачные биологические объекты прозрачными с сохранением целостности их внутренней структуры. Метод основан на специальной пробоподготовке, во время которой из клеток удаляются липиды и заменяются гидрогелевыми соединениями, такими как акриламид; при этом белки и нуклеиновые кислоты остаются интактными. Технология CLARITY предоставляет исследователям уникальную возможность изучать объемные биологические структуры с сохранением их внутренней организации, включая целых животных или эмбрионы, отдельные органы и искусственно выращенные органоиды, в частности церебральные. Данный протокол обобщает оптимизацию условий CLARITY для органоидов головного мозга человека и особенности подготовки образцов Light-Sheet микроскопии.