Характеристика деметилирующей ДНК-гликозилазы ROS1 из Nicotiana tabacum L.

Один из главных механизмов эпигенетической регуляции у высших эукариот основан на метилировании цитозина по положению C5 с образованием 5-метилцитозина (mC), который далее узнается регуляторными белками. У млекопитающих метилирование преимущественно протекает в динуклеотидах CG, тогда как у растений его мишенью служат последовательности CG, CHG и CHH (H – любое основание, кроме G). Корректное поддержание статуса метилирования ДНК требует баланса процессов метилирования, пассивного и активного деметилирования. В то время как у млекопитающих активное деметилирование происходит за счет направленного регулируемого повреждения mC в ДНК с последующим действием ферментов репарации, у растений функции деметилирования выполняют специализированные ДНК-гликозилазы, гидролизующие N-гликозидную связь mC-нуклеотидов. Геном модельного растения Arabidopsis thaliana кодирует четыре паралогичных белка, два из которых – DEMETER (DME) и REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) – обладают 5-метилцитозин-ДНК-гликозилазной активностью и необходимы для регуляции развития, ответа на инфекции и абиотический стресс и сайленсинга трансгенов и мобильных элементов. Гомологи DME и ROS1 присутствуют во всех группах растений, однако за пределами A. thaliana исследованы крайне слабо. В статье приведены результаты изучения свойств рекомбинантного фрагмента белка ROS1 из Nicotiana tabacum (NtROS1), содержащего основные структурные домены, необходимые для каталитической активности. Методами гомологичного моделирования была построена структурная модель NtROS1, в которой выявлена укладка, характерная для ДНК-гликозилаз структурного суперсемейства «спираль–шпилька–спираль». Рекомбинантный белок NtROS1 был способен удалять из ДНК основания mC, причем активность фермента слабо зависела от статуса метилирования CG-динуклеотидов в противоположной цепи. С меньшей эффективностью фермент удалял из ДНК 5-гидроксиметилцитозин (hmC), проявляя минимальную активность при наличии mC в противоположной цепи. При экспрессии гена NtROS1 в клетках человека в культуре происходило глобальное снижение уровня метилирования геномной ДНК. В целом можно сказать, что белок NtROS1 и другие гомологи DME и ROS1 представляют собой многообещающую основу для инженерии ферментов с целью анализа статуса эпигенетического метилирования и управления активностью генов.

1. Agius F., Kapoor A., Zhu J.-K. Role of the Arabidopsis DNA glycosylase/lyase ROS1 in active DNA demethylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103(31):11796-11801. DOI 10.1073/pnas.0603563103.

2. Ballestar E., Wolffe A.P. Methyl-CpG-binding proteins. Targeting specific gene repression. Eur. J. Biochem. 2001;268(1):1-6. DOI 10.1046/j.1432-1327.2001.01869.x.

3. Baubec T., Ivánek R., Lienert F., Schübeler D. Methylation-dependent and -independent genomic targeting principles of the MBD protein family. Cell. 2013;153(2):480-492. DOI 10.1016/j.cell.2013.03.011.

4. Bochtler M., Kolano A., Xu G.-L. DNA demethylation pathways: additional players and regulators. Bioessays. 2017;39(1):1-13. DOI 10.1002/bies.201600178.

5. Branco M.R., Ficz G., Reik W. Uncovering the role of 5-hydroxymethylcytosine in the epigenome. Nat. Rev. Genet. 2011;13(1):7-13. DOI 10.1038/nrg3080.

6. Choi C.-S., Sano H. Identification of tobacco genes encoding proteins possessing removal activity of 5-methylcytosines from intact tobacco DNA. Plant Biotechnol. 2007;24(3):339-344. DOI 10.5511/plantbiotechnology.24.339.

7. Choi W.L., Mok Y.G., Huh J.H. Application of 5-methylcytosine DNA glycosylase to the quantitative analysis of DNA methylation. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(3):1072. DOI 10.3390/ijms22031072.

8. Choi Y., Gehring M., Johnson L., Hannon M., Harada J.J., Goldberg R.B., Jacobsen S.E., Fischer R.L. DEMETER, a DNA glycosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed viability in Arabidopsis. Cell. 2002;110(1):33-42. DOI 10.1016/s0092-8674(02)00807-3.

9. Cléry A., Blatter M., Allain F.H.-T. RNA recognition motifs: boring? Not quite. Curr. Opin. Struct. Biol. 2008;18(3):290-298. DOI 10.1016/j.sbi.2008.04.002.

10. Devesa-Guerra I., Morales-Ruiz T., Pérez-Roldán J., Parrilla-Doblas J.T., Dorado-León M., García-Ortiz M.V., Ariza R.R., RoldánArjona T. DNA methylation editing by CRISPR-guided excision of 5-methylcytosine. J. Mol. Biol. 2020;432(7):2204-2216. DOI 10.1016/j.jmb.2020.02.007.

11. Fedorova O.S., Kuznetsov N.A., Koval V.V., Knorre D.G. Conformational dynamics and pre-steady-state kinetics of DNA glycosylases. Biochemistry (Moscow). 2010;75(10):1225-1239. DOI 10.1134/S0006297910100044.

12. Gong Z., Morales-Ruiz T., Ariza R.R., Roldán-Arjona T., David L., Zhu J.-K. ROS1, a repressor of transcriptional gene silencing in Arabidopsis, encodes a DNA glycosylase/lyase. Cell. 2002;111(6): 803-814. DOI 10.1016/s0092-8674(02)01133-9.

13. Gruber D.R., Toner J.J., Miears H.L., Shernyukov A.V., Kiryutin A.S., Lomzov A.A., Endutkin A.V., Grin I.R., Petrova D.V., Kupryushkin M.S., Yurkovskaya A.V., Johnson E., Okon M., Bagryanskaya E.G., Zharkov D.O., Smirnov S.L. Oxidative damage to epigenetically methylated sites affects DNA stability, dynamics, and enzymatic demethylation. Nucleic Acids Res. 2018;46(20):10827- 10839. DOI 10.1093/nar/gky893.

14. Hong S., Hashimoto H., Kow Y.W., Zhang X., Cheng X. The carboxyterminal domain of ROS1 is essential for 5-methylcytosine DNA glycosylase activity. J. Mol. Biol. 2014;426(22):3703-3712. DOI 10.1016/j.jmb.2014.09.010.

15. Iyer L.M., Abhiman S., Aravind L. Natural history of eukaryotic DNA methylation systems. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2011;101:25-104. DOI 10.1016/B978-0-12-387685-0.00002-0.

16. Jang H., Shin H., Eichman B.F., Huh J.H. Excision of 5-hydroxymethylcytosine by DEMETER family DNA glycosylases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014;446(4):1067-1072. DOI 10.1016/j.bbrc.2014.03.060.

17. Jumper J., Evans R., Pritzel A., Green T., Figurnov M., Ronneberger O., Tunyasuvunakool K., Bates R., ŽídekA., PotapenkoA., BridglandA., Meyer C., Kohl S.A.A., Ballard A.J., Cowie A., Romera-Paredes B., Nikolov S., Jain R., Adler J., Back T., Petersen S., Reiman D., Clancy E., Zielinski M., Steinegger M., Pacholska M., Berghammer T., Bodenstein S., Silver D., Vinyals O., Senior A.W., Kavukcuoglu K., Kohli P., Hassabis D. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 2021;596(7873):583-589. DOI 10.1038/s41586-021-03819-2.

18. Kapazoglou A., Drosou V., Argiriou A., Tsaftaris A.S. The study of a barley epigenetic regulator, HvDME, in seed development and under drought. BMC Plant Biol. 2013;13:172. DOI 10.1186/1471-2229-13-172.

19. Kapoor A., Agarwal M., Andreucci A., Zheng X., Gong Z., Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.-K. Mutations in a conserved replication protein suppress transcriptional gene silencing in a DNAmethylation-independent manner in Arabidopsis. Curr. Biol. 2005; 15(21):1912-1918. DOI 10.1016/j.cub.2005.09.013.

20. Le T.-N., Schumann U., Smith N.A., Tiwari S., Au P.C.K., Zhu Q.-H., Taylor J.M., Kazan K., Llewellyn D.J., Zhang R., Dennis E.S., Wang M.-B. DNA demethylases target promoter transposable elements to positively regulate stress responsive genes in Arabidopsis. Genome Biol. 2014;15(9):458. DOI 10.1186/s13059-014-0458-3.

21. Lee T.-F., Zhai J., Meyers B.C. Conservation and divergence in eukaryotic DNA methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010;107(20): 9027-9028. DOI 10.1073/pnas.1005440107.

22. Li X., Qian W., Zhao Y., Wang C., Shen J., Zhu J.-K., Gong Z. Antisilencing role of the RNA-directed DNA methylation pathway and a histone acetyltransferase in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012;109(28):11425-11430. DOI 10.1073/pnas.1208557109.

23. Li Y., Kumar S., Qian W. Active DNA demethylation: mechanism and role in plant development. Plant Cell Rep. 2018;37(1):77-85. DOI 10.1007/s00299-017-2215-z.

24. Liu R., How-Kit A., Stammitti L., Teyssier E., Rolin D., Mortain-Bertrand A., Halle S., Liu M., Kong J., Wu C., Degraeve-Guibault C., Chapman N.H., Maucourt M., Hodgman T.C., Tost J., Bouzayen M., Hong Y., Seymour G.B., Giovannoni J.J., Gallusci P. A DEMETERlike DNA demethylase governs tomato fruit ripening. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015;112(34):10804-10809. DOI 10.1073/pnas.1503362112.

25. Morales-Ruiz T., Ortega-Galisteo A.P., Ponferrada-Marín M.I., Martínez-Macías M.I., Ariza R.R., Roldán-Arjona T. DEMETER and REPRESSOR OF SILENCING 1 encode 5-methylcytosine DNA glycosylases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103(18):6853-6858. DOI 10.1073/pnas.0601109103.

26. Ono A., Yamaguchi K., Fukada-Tanaka S., Terada R., Mitsui T., Iida S. A null mutation of ROS1a for DNA demethylation in rice is not transmittable to progeny. Plant J. 2012;71(4):564-574. DOI 10.1111/j.1365-313X.2012.05009.x.

27. Ortega-Galisteo A.P., Morales-Ruiz T., Ariza R.R., Roldán-Arjona T. Arabidopsis DEMETER-LIKE proteins DML2 and DML3 are required for appropriate distribution of DNA methylation marks. Plant Mol. Biol. 2008;67(6):671-681. DOI 10.1007/s11103-008-9346-0.

28. Parrilla-Doblas J.T., Roldán-Arjona T., Ariza R.R., Córdoba-Cañero D. Active DNA demethylation in plants. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20(19):4683. DOI 10.3390/ijms20194683.

29. Pastor W.A., Aravind L., Rao A. TETonic shift: biological roles of TET proteins in DNA demethylation and transcription. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2013;14(6):341-356. DOI 10.1038/nrm3589.

30. Pastor W.A., Pape U.J., Huang Y., Henderson H.R., Lister R., Ko M., McLoughlin E.M., Brudno Y., Mahapatra S., Kapranov P., Tahiliani M., Daley G.Q., Liu X.S., Ecker J.R., Milos P.M., Agarwal S., Rao A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 2011;473(7347):394-397. DOI 10.1038/nature10102.

31. Penterman J., Uzawa R., Fischer R.L. Genetic interactions between DNA demethylation and methylation in Arabidopsis. Plant Physiol. 2007;145(4):1549-1557. DOI 10.1104/pp.107.107730.

32. Ponferrada-Marín M.I., Parrilla-Doblas J.T., Roldán-Arjona T., Ariza R.R. A discontinuous DNA glycosylase domain in a family of enzymes that excise 5-methylcytosine. Nucleic Acids Res. 2011;39(4): 1473-1484. DOI 10.1093/nar/gkq982.

33. Ponferrada-Marín M.I., Roldán-Arjona T., Ariza R.R. ROS1 5-methylcytosine DNA glycosylase is a slow-turnover catalyst that initiates DNA demethylation in a distributive fashion. Nucleic Acids Res. 2009;37(13):4264-4274. DOI 10.1093/nar/gkp390.

34. Porello S.L., Leyes A.E., David S.S. Single-turnover and pre-steadystate kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 1998;37(42): 14756-14764. DOI 10.1021/bi981594+.

35. Roldán-Arjona T., Ariza R.R., Córdoba-Cañero D. DNA base excision repair in plants: an unfolding story with familiar and novel characters. Front. Plant Sci. 2019;10:1055. DOI 10.3389/fpls.2019.01055.

36. Waterhouse A., Bertoni M., Bienert S., Studer G., Tauriello G., Gumienny R., Heer F.T., de Beer T.A.P., Rempfer C., Bordoli L., Lepore R., Schwede T. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W296- W303. DOI 10.1093/nar/gky427.

37. Wen S., Wen N., Pang J., Langen G., Brew-Appiah R.A.T., Mejias J.H., Osorio C., Yang M., Gemini R., Moehs C.P., Zemetra R.S., Kogel K.-H., Liu B., Wang X., von Wettstein D., Rustgi S. Structural genes of wheat and barley 5-methylcytosine DNA glycosylases and their potential applications for human health. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012;109(50):20543-20548. DOI 10.1073/pnas.1217927109.

38. Wu X., Zhang Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nat. Rev. Genet. 2017;18(9):517-534. DOI 10.1038/nrg.2017.33.

39. Yamamuro C., Miki D., Zheng Z., Ma J., Wang J., Yang Z., Dong J., Zhu J.-K. Overproduction of stomatal lineage cells in Arabidopsis mutants defective in active DNA demethylation. Nat. Commun. 2014;5:4062. DOI 10.1038/ncomms5062.

40. Yu M., Hon G.C., Szulwach K.E., Song C.-X., Zhang L., Kim A., Li X., Dai Q., Shen Y., Park B., Min J.-H., Jin P., Ren B., He C. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 2012;149(6):1368-1380. DOI 10.1016/j.cell.2012.04.027.

41. Zahid O.K., Zhao B.S., He C., Hall A.R. Quantifying mammalian genomic DNA hydroxymethylcytosine content using solid-state nanopores. Sci. Rep. 2016;6:29565. DOI 10.1038/srep29565. Zemach A., Zilberman D. Evolution of eukaryotic DNA methylation and the pursuit of safer sex. Curr. Biol. 2010;20(17):R780-R785. DOI 10.1016/j.cub.2010.07.007.

42. Zharkov D.O. Base excision DNA repair. Cell. Mol. Life Sci. 2008; 65(10):1544-1565. DOI 10.1007/s00018-008-7543-2.

43. Zhu J., Kapoor A., Sridhar V.V., Agius F., Zhu J.-K. The DNA glycosylase/lyase ROS1 functions in pruning DNA methylation patterns in Arabidopsis. Curr. Biol. 2007;17(1):54-59. DOI 10.1016/j.cub.2006.10.059.