Один из главных механизмов эпигенетической регуляции у высших эукариот основан на метилировании цитозина по положению C5 с образованием 5-метилцитозина (mC), который далее узнается регуляторными белками. У млекопитающих метилирование преимущественно протекает в динуклеотидах CG, тогда как у растений его мишенью служат последовательности CG, CHG и CHH (H – любое основание, кроме G). Корректное поддержание статуса метилирования ДНК требует баланса процессов метилирования, пассивного и активного деметилирования. В то время как у млекопитающих активное деметилирование происходит за счет направленного регулируемого повреждения mC в ДНК с последующим действием ферментов репарации, у растений функции деметилирования выполняют специализированные ДНК-гликозилазы, гидролизующие N-гликозидную связь mC-нуклеотидов. Геном модельного растения Arabidopsis thaliana кодирует четыре паралогичных белка, два из которых – DEMETER (DME) и REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) – обладают 5-метилцитозин-ДНК-гликозилазной активностью и необходимы для регуляции развития, ответа на инфекции и абиотический стресс и сайленсинга трансгенов и мобильных элементов. Гомологи DME и ROS1 присутствуют во всех группах растений, однако за пределами A. thaliana исследованы крайне слабо. В статье приведены результаты изучения свойств рекомбинантного фрагмента белка ROS1 из Nicotiana tabacum (NtROS1), содержащего основные структурные домены, необходимые для каталитической активности. Методами гомологичного моделирования была построена структурная модель NtROS1, в которой выявлена укладка, характерная для ДНК-гликозилаз структурного суперсемейства «спираль–шпилька–спираль». Рекомбинантный белок NtROS1 был способен удалять из ДНК основания mC, причем активность фермента слабо зависела от статуса метилирования CG-динуклеотидов в противоположной цепи. С меньшей эффективностью фермент удалял из ДНК 5-гидроксиметилцитозин (hmC), проявляя минимальную активность при наличии mC в противоположной цепи. При экспрессии гена NtROS1 в клетках человека в культуре происходило глобальное снижение уровня метилирования геномной ДНК. В целом можно сказать, что белок NtROS1 и другие гомологи DME и ROS1 представляют собой многообещающую основу для инженерии ферментов с целью анализа статуса эпигенетического метилирования и управления активностью генов.

Рапс (Brassica napus L.) и сурепица (B. rapa L. subsp. campestris (L.)) – важные сельскохозяйственные культуры, широко используются для продовольственных, кормовых и технических целей, а также в качестве сидератов. За последние десятилетия создано большое количество перспективных сортов, культивируемых практически во всех регионах России. Для повышения эффективности селекционного процесса и успешного развития семеноводства необходимо внедрять современные молекулярно-генетические методы оценки видового и сортового разнообразия. Цель настоящей работы заключалась в изучении ДНК-полиморфизма сортов рапса и сурепицы селекции Федерального научного центра кормопроизводства и агроэкологии им. В.Р. Вильямса и выявлении информативных маркеров для сортовой идентификации и генетической паспортизации. Для генотипирования 18 образцов геномной ДНК использовали 42 и 25 комбинаций SSR- и SRAP-праймеров соответственно. Результаты показали, что маркеры SRAP более эффективны для анализа полиморфизма изучаемого материала: 36 % от общего числа испытанных маркеров демонстрировали генетический полиморфизм, тогда как для микросателлитных локусов этот показатель равнялся 16.7 %. Определены молекулярные маркеры для выявления различий на межвидовом и межсортовом уровнях. Информативными для исследуемой выборки сортов оказались микросателлитные локусы Na12A02, Ni2C12, Ni02-D08a, Ra02-E01, Ni03H07а и комбинации SRAP-маркеров F13-R9, Me4-R7, F11-Em2, F10-R7, F9-Em2 и F9-R8. Анализ сортового материала по двум системам маркирования показал более высокий уровень ДНК-полиморфизма у образцов растений разного типа развития (яровой/озимый) в сравнении с различиями между сортами в пределах вида или группы. Согласно индексам генетического разнообразия Нея, в кластере сортов озимого рапса наибольшей генетической удаленностью выделялись ВИК 2 и Горизонт, среди яровых – Новосёл и Велес. Высокий уровень сходства обнаружен между яровыми сортами рапса Викрос и Бизон. Полученная информация имеет практическое значение для контроля сортовой принадлежности и генетической паспортизации семенного материала сортов рапса и сурепицы.

Альбумины SCA и SAA – короткие гидрофильные белки, содержащиеся в высокой концентрации в семядолях и оси семени сухих семян гороха (Pisum sativum L.). Ранее показано, что альбумин SCA имеет два аллельных варианта, различающихся подвижностью в электрофорезе в полиакриламидном геле в кислой среде. С их помощью соответствующий ген SCA картирован в группе сцепления V. Белок SCA был использован как генетический и филогеографический маркер, что до сих пор предполагало проведение электрофореза белков, тогда как последовательность кодирующего гена SCA оставалась неизвестной. На основе данных, доступных в публичных репозиториях, в районе генома гороха, соответствующего позиции гена SCA на генетической карте с учетом синтении геномов гороха и люцерны, осуществлен поиск кандидатов на роль этого гена в зависимости от длины его белкового продукта, положительного заряда в кислых условиях и количества остатков лизина, ранее оцененного электрофоретическими методами. Выявленные гены просеквенированы у ряда образцов гороха. Соответствие полученных электрофоретических данных и нуклеотидной изменчивости позволило идентифицировать последовательность Psat0s797g0160 из референсного генома гороха в качестве гена SCA. Последовательность Psat0s797g0240, возможно, кодирует родственный минорный альбумин SA-a2, тогда как ген-кандидат альбумина SAA
остается неидентифицированным (как и электрофоретическая изменчивость двух белков, упомянутых последними). Амплификация ДНК с использованием оригинальных праймеров SCA1_3f и SCA1_3r и геномной ДНК в качестве матрицы, а также расщепление ее эндонуклеазой рестрикции HindII позволяют различать аллели гена SCA, белковые продукты которых имеют разный заряд, без секвенирования. Таким образом, ген, кодирующий высокогидрофильный альбумин SCA, накапливающийся в семядолях гороха, аллели которого полезны для классификации диких родственников культурного гороха, идентифицирован в геноме гороха, и на его основе разработан удобный CAPS-маркер.

Расстройства аутистического спектра (РАС) – это группа состояний, возникающих в детском возрасте, для которых характерны трудности с социальным взаимодействием и общением, a также нетипичные модели поведения и склонность к стереотипии. Механизмы возникновения этой группы расстройств до сих пор не вполне понятны, и, следовательно, отсутствуют соответствующие методы профилактики. Целью исследования была оценка плотности нейронов в медиальной префронтальной коре и четырех областях гиппокампа, а именно СA1, СA2, СA3 и зубчатой извилины (DG) у мышей линии Clstn2-KO, которая может выступать в качестве генетической модели РАС. Кроме того, охарактеризовали уровень нейрогенеза в области DG гиппокампа. Данная линия получена путем нокаута гена кальсинтенина-2 (Clstn2) на основе мышей линии С57BL/6J; последняя была использована в настоящем исследовании в качестве контроля. Для определения плотности нейронов изготавливали серийные срезы соответствующих областей мозга на криотоме с последующим иммуногистохимическим окрашиванием и конфокальной микроскопией, для чего использовали нейрональный маркер (anti-NeuN) в качестве первичного антитела. Наряду с этим в области DG гиппокампа оценивали нейрогенез, для чего проводили иммуногистохимическое окрашивание с применением антитела против даблкортина (anti-DCX). В обоих случаях в качестве вторичного антитела был Goat anti-rabbit IgG. Плотность нейронов в области гиппокампа СА1 была снижена как у самцов, так и самок мышей Clstn2-KO по сравнению с контролем; у самцов обеих линий плотность нейронов была ниже в этой области по сравнению с самками. Помимо этого, были обнаружены различия между самцами и самками в двух других областях гиппокампа: в области CA2 – у мышей обеих исследованных линий, а в области CA3 лишь у мышей C57BL/6J плотность нейронов была меньше у самцов по сравнению с самками. Различий между исследованными группами в уровне нейрогенеза, а также в плотности нейронов в префронтальной коре и области DG гиппокампа не обнаружено. Полученные результаты показывают, что нокаут по гену Clstn2 приводит к избирательному снижению плотности нейронов в области CA1 гиппокампа, что может представлять собой клеточную мишень для ранней профилактики и возможной терапии РАС.

Выяснение наследственной предрасположенности к судорогам в ответ на специфические внешние стимулы важно для понимания причин эпилептиформных состояний, нахождения новых методов их предупреждения и лечения. Особи водяной полевки с судорожными припадками встречаются как в природных, так и лабораторных условиях. Проанализированы данные многолетнего содержания и разведения водяных полевок в условиях вивария с целью установления наследственной предрасположенности к судорожным припадкам и влияния пола и возраста на их развитие. В условиях вивария припадки были спровоцированы взятием в руки и отмечены у 2.4 % полевок, отловленных в природной популяции с циклическими колебаниями численности. Судорожные припадки чаще встречали у особей, отловленных в фазы спада и депрессии численности, чем у особей с фаз подъема или пика. Судорожные состояния, вероятно, служат элементом адаптивного поведения, сформировавшегося в системе «хищник–жертва». В природных условиях особи, предрасположенные к судорожным припадкам, могут иметь селективное преимущество при усилении пресса хищников. Судорожные припадки в ответ на хэндлинг отмечены у 29.8 % потомков водяных полевок виварного разведения. Доля таких особей существенно увеличивалась, если у одного или обоих родителей регистрировали судорожные состояния, что свидетельствует о наследственной предрасположенности к припадкам. В парах «родители–потомки» обнаружена достоверная корреляция среднего возраста наступления первых припадков (r = 0.42, p < 0.01). Минимальный возраст регистрации припадков у водяной полевки составляет 39 дней, максимальный – 1105, медианный – 274 дня. Предрасположенность к припадкам не связана с полом. Гены, контролирующие возникновение судорожных состояний, оказывают плейотропное действие на продолжительность жизни: особи с судорожными припадками в условиях вивария живут дольше, чем особи с нормальным фенотипом. Водяная полевка может служить подходящим модельным объектом для изучения природы судорожных состояний и эволюции долголетия.

В последние годы увеличивается количество полногеномных исследований ассоциаций (ПГИА, GWAS), проведенных для различных экономически важных признаков животных. Результаты этих исследований представлены в виде суммарных статистик, которые можно использовать для изучения генетического контроля экономически важных признаков сельскохозяйственных животных, в том числе и при разработке методик маркер-ориентированной селекции. В большинстве случаев ПГИА сельскохозяйственных животных не соответствуют общепринятым в области исследований генетики человека стандартам формата публикаций результатов ПГИА в виде суммарных статистик (наличие информации об эффекторном и референсном аллелях, значение и направление эффекта и др.). Это существенно затрудняет использование суммарных статистик для нужд селекции. В области исследований генетики человека имеется несколько технологических решений для анализа результатов ПГИА, в том числе одно из самых крупных – платформа GWAS-MAP. Для других видов живых организмов, включающих и экономически важных сельскохозяйственных животных, подобных решений нет. В настоящей работе мы сфокусировались на создании схожей платформы для работы с суммарными статистиками ПГИА различных признаков овец, так как овцеводство в последнее время становится все более актуальной областью сельского хозяйства. По аналогии с платформой GWAS-MAP для хранения, унификации и анализа GWAS человека мы создали платформу GWAS-MAP|ovis. На сегодняшний день платформа содержит информацию о более чем 34 млн ассоциаций между вариантами геномной последовательности и признаками мясной продуктивности. Платформа может быть использована и для проведения анализа колокализации – метода, который позволяет установить, является ли ассоциация определенного локуса с двумя разными признаками результатом плейотропии или же данные признаки ассоциированы с разными вариантами, которые находятся в неравновесии по сцеплению. Эта платформа будет полезна как селекционерам для выбора перспективных маркеров для селекции (эффекты и аллели различных маркеров, влияющих на изучаемые признаки), так и для ученых, ведущих исследования в области генетики овец.

Статья посвящена исследованию микробиома хлебных заквасок спонтанного брожения. Цель работы – изучение влияния технологических параметров ведения заквасок на таксономическую структуру микробиома хлебных заквасок спонтанного брожения. Объектами исследования являлись две закваски спонтанного брожения – густая ржаная и жидкая ржаная без заварки, приготовленные с использованием одной партии муки ржаной обдирной. Для изучения таксономической структуры заквасочного микробиома в динамике применяли метод высокопроизводительного секвенирования фрагментов генов 16S рРНК микроорганизмов. Показано, что технологические параметры ведения заквасок (влажность, температура) не оказывают влияния на таксономический состав микробиома густой ржаной и жидкой ржаной заквасок на уровне филумов/классов/родов (но не видов). Установлено, что в течение первых трех суток ведения в микробном сообществе доминировали бактерии из филумов Proteobacteria и Firmicutes. В филуме Proteobacteria большую долю занимали микроорганизмы из порядка Enterobacterales, которые сохранялись в течение трех суток ведения заквасок. Филум Firmicutes был представлен молочнокислыми бактериями родов Weissella, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus. Классическими микробиологическими методами установлено, что через одни сутки брожения количество клеток молочнокислых бактерий было значительно выше в жидкой ржаной закваске по сравнению с густой, однако при дальнейшем ведении заквасок количество клеток было сопоставимым, при этом происходили существенные изменения на уровне родов и видов. Выявлено, что по мере увеличения относительной численности молочнокислых бактерий рода Lactobacillus происходило постепенное вытеснение кокковых форм Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, Pediococcus. При дальнейшем ведении заквасок через 10 суток положение доминирующих групп бактерий занимали представители филума Firmicutes – молочнокислые бактерии рода Lactobacillus. Показано влияние режима и параметров ведения заквасок на видовой состав лактобацилл, который демонстрировал низкое бактериальное разнообразие. В первые трое суток ведения в обеих заквасках доминировали лактобациллы L. curvatus, L. brevis и Lactiplantibacillus sp. Через месяц ведения в густой ржаной закваске доминировали Fructilactobacillus sanfranciscensis и Companilactobacillus sp., а в жидкой ржаной – L. pontis.

В связи с прекращением после 1980 г. массовой противооспенной вакцинации в настоящее время практически полностью утрачен коллективный иммунитет человеческой популяции к ортопоксвирусным инфекциям. Вследствие этого увеличилась опасность распространения в мире зоонозных ортопоксвирусных инфекций человека, обусловленных вирусами оспы обезьян или оспы коров. Противооспенные вакцины первого поколения на основе вируса осповакцины (Vaccinia virus, VAC) являются реактогенными и поэтому в современных условиях не пригодны для массовой вакцинации. Это обусловливает необходимость разработки современных безопасных живых вакцин на основе VAC с применением методов генетической инженерии. С использованием метода временной доминантной селекции нами создан штамм VACΔ6, в геноме которого пять генов вирулентности направленно делетированы, а один ген инактивирован встройкой синтетического фрагмента ДНК. В процессе получения штамма VACΔ6 из клонового варианта VAC LIVP вирус прошел 71 пассаж в культуре клеток CV-1. Такая длинная пассажная история могла привести к дополнительным нецелевым изменениям в геноме штамма VACΔ6 относительно исходного LIVP. Поэтому для оценки возможных нецелевых изменений провели полногеномное секвенирование VAC LIVP, VACΔ6 и пяти промежуточных штаммов вируса. Сравнительный анализ полных вирусных геномов показал, что, помимо целевых нарушений, спонтанно произошли только две нуклеотидные замены при получении VACΔ4 из штамма VACΔ3 и сохранившиеся в геноме VACΔ5 и VACΔ6. При этом обе эти замены находятся в межгенных участках (позиции 1431 и 189738 относительно штамма LIVP), что указывает на крайне редкое возникновение нецелевых изменений при использовании методики временной доминантной селекции для получения рекомбинантных VAC со множественными встройками/делециями. Для выяснения стабильности генома полученного аттенуированного вакцинного штамма и в соответствии с «Руководством по проведению клинических исследований лекарственных средств…» выполнено 15 последовательных циклов культивирования производственного штамма вируса VACΔ6 в культуре клеток 4647, аттестованной для производства вакцины. ПЦР-анализ и секвенирование шести фрагментов ДНК, соответствующих районам нарушаемых генов VACΔ6, показали, что после 15 пассажей в культуре клеток 4647 все последовательности вирусной ДНК остались неизменными.

За последние 20 лет коронавирусы вызвали три эпидемии, SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV2, причем летальность первых двух была очень высокой: около 10 и 26 % соответственно. Последняя вспышка коронавирусной инфекции, вызванная SARS-CoV2 в 2019 г. в Китае, охватила всю планету, и она все еще продолжает распространяться. Источником этих вирусов у человека были животные: летучие мыши, гималайские циветы и верблюды. Геномы MERS-CoV, SARS-CoV и SARS-CoV2 имеют высокое сходство между собой. Установлено, что заражение коронавирусной инфекцией (SARS-CoV и SARS-CoV2) происходит посредством контакта вирусного белка S с рецептором легочного эпителия – ангиотензин-конвертирующим ферментом 2 (АСЕ2), благодаря чему вирус попадает в клетки. Наиболее привлекательной моделью для исследования особенностей развития этих заболеваний является лабораторная мышь, которая, однако, резистентна к коронавирусной инфекции. Резистентность объясняется различием аминокислотного состава белков Асе2 мыши и АСЕ2 человека. Поэтому при получении мышей, восприимчивых к коронавирусам SARS-CoV и SARS-CoV2, в их геном переносят ген АСЕ2 человека. Экзогенная ДНК конструкций встраивается в реципиентный геном случайным образом и с варьирующим числом копий. На основе этой технологии были получены линии трансгенных мышей, восприимчивых к интраназальной коронавирусной инфекции. Применение технологии адресной модификации геномов с помощью CRISPR/Cas9 позволило получить линии трансгенных животных с инсерцией гена АСЕ2 человека под контроль промотора эндогенного гена Асе2 мыши. Такая «гуманизация» гена Ace2 дает возможность получить животных, наиболее близко имитирующих коронавирусную инфекцию человека. Таким образом, к настоящему времени создана серия линий трансгенных мышей – животных, моделирующих коронавирусные инфекции человека и потенциально способных служить платформами для тестирования вакцин.