Стабильность генома вакцинного штамма VAC∆6

В связи с прекращением после 1980 г. массовой противооспенной вакцинации в настоящее время практически полностью утрачен коллективный иммунитет человеческой популяции к ортопоксвирусным инфекциям. Вследствие этого увеличилась опасность распространения в мире зоонозных ортопоксвирусных инфекций человека, обусловленных вирусами оспы обезьян или оспы коров. Противооспенные вакцины первого поколения на основе вируса осповакцины (Vaccinia virus, VAC) являются реактогенными и поэтому в современных условиях не пригодны для массовой вакцинации. Это обусловливает необходимость разработки современных безопасных живых вакцин на основе VAC с применением методов генетической инженерии. С использованием метода временной доминантной селекции нами создан штамм VACΔ6, в геноме которого пять генов вирулентности направленно делетированы, а один ген инактивирован встройкой синтетического фрагмента ДНК. В процессе получения штамма VACΔ6 из клонового варианта VAC LIVP вирус прошел 71 пассаж в культуре клеток CV-1. Такая длинная пассажная история могла привести к дополнительным нецелевым изменениям в геноме штамма VACΔ6 относительно исходного LIVP. Поэтому для оценки возможных нецелевых изменений провели полногеномное секвенирование VAC LIVP, VACΔ6 и пяти промежуточных штаммов вируса. Сравнительный анализ полных вирусных геномов показал, что, помимо целевых нарушений, спонтанно произошли только две нуклеотидные замены при получении VACΔ4 из штамма VACΔ3 и сохранившиеся в геноме VACΔ5 и VACΔ6. При этом обе эти замены находятся в межгенных участках (позиции 1431 и 189738 относительно штамма LIVP), что указывает на крайне редкое возникновение нецелевых изменений при использовании методики временной доминантной селекции для получения рекомбинантных VAC со множественными встройками/делециями. Для выяснения стабильности генома полученного аттенуированного вакцинного штамма и в соответствии с «Руководством по проведению клинических исследований лекарственных средств…» выполнено 15 последовательных циклов культивирования производственного штамма вируса VACΔ6 в культуре клеток 4647, аттестованной для производства вакцины. ПЦР-анализ и секвенирование шести фрагментов ДНК, соответствующих районам нарушаемых генов VACΔ6, показали, что после 15 пассажей в культуре клеток 4647 все последовательности вирусной ДНК остались неизменными.

1. Albarnaz J.D., Torres A.A., Smith G.L. Modulating vaccinia virus immunomodulators to improve immunological memory. Viruses. 2018; 10(3):101. DOI 10.3390/v10030101.

2. Blanchard T.J., Alcami A., Andrea P., Smith G.L. Modified vaccinia virus Ankara undergoes limited replication in human cells and lacks several immunomodulatory proteins: implications for use as a human vaccine. J. Gen. Virol. 1998;79(Pt. 5):1159-1167. DOI 10.1099/0022-1317-79-5-1159.

3. Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V., Sutter G. Highly attenuated modified vaccinia virus Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells. J. Gen. Virol. 1998;79(Pt. 2): 347-352. DOI 10.1099/0022-1317-79-2-347.

4. Eto A., Saito T., Yokote H., Kurane I., Kanatani Y. Recent advances in the study of live attenuated cell-cultured smallpox vaccine LC16m8. Vaccine. 2015;33(45):6106-6111. DOI 10.1016/j.vaccine.2015.07.111.

5. Falkner F.G., Moss B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 1990;64(6):3108-3111. DOI 10.1128/JVI.64.6.3108-3111.1990.

6. Guidelines for Clinical Trials of Medicinal Products (Immunobiological Medicinal Products). Part 2. Moscow: Grif and K Publ., 2012. (in Russian)

7. Katoh K., Misawa K., Kuma K., Miyata T. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Res. 2002;30(14):3059-3066. DOI 10.1093/nar/gkf436.

8. Kidokoro M., Shida H. Vaccinia virus LC16m8∆ as a vaccine vector for clinical applications. Vaccines. 2014;2(4):755-771. DOI 10.3390/vaccines2040755.

9. Kretzschmar M., Wallinga J., Teunis P., Xing S., Mikolajczyk R. Frequency of adverse events after vaccination with different vaccinia strains. PLoS Med. 2006;3(8):e272. DOI 10.1371/journal.pmed.0030272.

10. Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows– Wheeler transform. Bioinformatics. 2009;25(14):1754-1760. DOI 10.1093/bioinformatics/btp324.

11. Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009;25(16):2078-2079. DOI 10.1093/bioinformatics/btp352.

12. McKenna A., Hanna M., Banks E., Sivachenko A., Cibulskis K., Kernytsky A., Garimella K., Altshuler D., Gabriel S., Daly M., DePristo M.A. The genome analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010;20(9):1297-1303. DOI 10.1101/gr.107524.110.

13. Moss B. Smallpox vaccines: Targets of protective immunity. Immunol. Rev. 2011;239(1):8-26. DOI 10.1111/j.1600-065X.2010.00975.x.

14. Nolen L.D., Osadebe L., Katomba J., Likofata J., Mukadi D., Monroe B., Doty J., Hughes C.M., Kabamba J., Malekani J., Bomponda P.L., Lokota J.I., Balilo M.P., Likafi T., Lushima R.S., Ilunga B.K., Nkawa F., Pukuta E., Karhemere S., Tamfum J.J., Nguete B., Wemakoy E.O., McCollum A.M., Reynolds M.G. Extended human-to-human transmission during a monkeypox outbreak in the Democratic Republic of the Congo. Emerg. Infect. Dis. 2016;22(6):1014-1021. DOI 10.3201/eid2206.150579.

15. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8):1166-1167. DOI 10.1093/bioinformatics/bts091.

16. Reynolds M.G., Doty J.B., McCollum A.M., Olson V.A., Nakazawa Y. Monkeypox re-emergence in Africa: a call to expand the concept and practice of One Health. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2019;17(2): 129-139. DOI 10.1080/14787210.2019.1567330.

17. Robinson J.T., Thorvaldsdottir H., Winckler W., Guttman M., Lander E.S., Getz G., Mesirov J.P. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 2011;29(1):24-26. DOI 10.1038/nbt.1754.

18. Sanchez-Sampedro L., Perdiguero B., Mejias-Perez E., Garcia-Arriaza J., Di Pilato M., Esteban M. The evolution of poxvirus vaccines. Viruses. 2015;7(4):1726-1803. DOI 10.3390/v7041726.

19. Shchelkunov S.N. Emergence and reemergence of smallpox: the need in development of a new generation smallpox vaccine. Vaccine. 2011;29(Suppl. 4):D49-D53. DOI 10.1016/j.vaccine.2011.05.037.

20. Shchelkunov S.N. An increasing danger of zoonotic orthopoxvirus infections. PLoS Pathog. 2013;9(12):e1003756. DOI 10.1371/journal.ppat.1003756.

21. Shchelkunov S.N., Shchelkunova G.A. Genes that control vaccinia virus immunogenicity. Acta Naturae. 2020;12(1):33-41. DOI 10.32607/actanaturae.10935.

22. Singh R.K., Balamurugan V., Bhanuprakash V., Venkatesan G., Hosamani M. Emergence and reemergence of vaccinia-like viruses: global scenario and perspectives. Indian J. Virol. 2012;23(1):1-11. DOI 10.1007/s13337-012-0068-1.

23. Smallpox and its Eradication. Geneva: World Health Organization, 1988.

24. Volz A., Sutter G. Modified vaccinia virus Ankara. History, value in basic research, and current perspectives for vaccine development. Adv. Virus Res. 2017;97:187-243. DOI 10.1016/bs.aivir.2016.07.001.

25. Yakubitskiy S.N., Kolosova I.V., Maksyutov R.A., Shchelkunov S.N. Attenuation of vaccinia virus. Acta Naturae. 2015;7(4):113-121. DOI 10.32607/20758251-2015-7-4-113-121.

26. Yakubitskiy S.N., Kolosova I.V., Maksyutov R.A., Shchelkunov S.N. Highly immunogenic variant of attenuated vaccinia virus. Dokl. Biochem. Biophys. 2016;466:35-38. DOI 10.1134/S1607672916010105.