Анализ транскрипционной активности модельных piggyBac-трансгенов, стабильно интегрированных в разные локусы генома культивируемых клеток CHO при отсутствии селекционного давления

Культивируемые клетки яичника китайского хомячка (CHO) наиболее часто используются для синтеза рекомбинантных белков в биофармацевтическом производстве. При получении стабильных клеточных линий-продуцентов локус интеграции трансгена в геном оказывает большое влияние на уровень его экспрессии (явление, известное как эффект положения гена). Соответственно, поиск локусов генома, обеспечивающих высокий уровень продукции белков, является актуальной практической задачей. В данной работе мы использовали метод TRIP для исследования влияния локального окружения хроматина на активность трансгенов, встроенных в разные локусы генома культивируемых клеток CHO. С этой целью репортерные конструкции, кодирующие белок eGFP под контролем четырех разных промоторов, были стабильно встроены в геном клеток CHO при помощи транспозона piggyBac. При этом каждый отдельный трансген содержал уникальную метку – ДНК-штрихкод. Полученная трансгенная поликлональная популяция клеток была культивирована в течение месяца без какой-либо селекции. Далее при помощи присутствующих в конструкциях штрихкодов и высокопроизводительного секвенирования были определены сайты локализации трансгенов в геноме, измерена их представленность в популяции, а также транскрипционная активность. Всего удалось полностью охарактеризовать около 640 трансгенов, более-менее равномерно распределенных по всем хромосомам клеток CHO. Более половины трансгенов оказались полностью молчащими. Наиболее активные трансгены выявлены в окрестностях геномных сайтов инициации транскрипции – в промоторных и 5’-некодирующих районах генов. Наибольшей активностью обладали трансгены, несущие полноразмерный промотор гена EF-1α китайского хомячка. Трансгены с укороченным вариантом этого же промотора, а также трансгены с промотором мышиного гена PGK (mPGK) были соответственно в среднем в 10 и 19 раз менее активны. В целом в результате данной работы выявлены сочетания локусов генома культивируемых клеток CHO и промоторных элементов, которые обеспечивают разные уровни транскрипционной активности модельной репортерной конструкции.

1. Akhtar W., de Jong J., Pindyurin A.V., Pagie L., Meuleman W., de Ridder J., Berns A., Wessels L.F.A., van Lohuizen M., van Steensel B. Chromatin position effects assayed by thousands of reporters integrated in parallel. Cell. 2013;154(4):914-927. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.07.018

2. Akhtar W., Pindyurin A.V., de Jong J., Pagie L., ten Hoeve J., Berns A., Wessels L.F.A., van Steensel B., van Lohuizen M. Using TRIP for genome-wide position effect analysis in cultured cells. Nat. Protoc. 2014;9(6):1255-1281. https://doi.org/10.1038/nprot.2014.072

3. Babenko V.N., Makunin I.V., Brusentsova I.V., Belyaeva E.S., Maksimov D.A., Belyakin S.N., Maroy P., Vasil′eva L.A., Zhimulev I.F. Paucity and preferential suppression of transgenes in late replication domains of the D. melanogaster genome. BMC Genomics. 2010;11: 318. https://doi.org/10.1186/1471-2164-11-318

4. Chen M., Licon K., Otsuka R., Pillus L., Ideker T. Decoupling epigenetic and genetic effects through systematic analysis of gene position. Cell Rep. 2013;3(1):128-137. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2012.12.003

5. Chen Q., Luo W., Veach R.A., Hickman A.B., Wilson M.H., Dyda F. Structural basis of seamless excision and specific targeting by piggyBac transposase. Nat. Commun. 2020;11(1):3446. https://doi.org/10.1038/s41467-020-17128-1

6. Dahodwala H., Lee K.H. The fickle CHO: a review of the causes, implications, and potential alleviation of the CHO cell line instability problem. Curr. Opin. Biotechnol. 2019;60:128-137. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2019.01.011

7. Ding S., Wu X., Li G., Han M., Zhuang Y., Xu T. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 2005;122(3):473-483. https://doi.org/10.1016/j.cell.2005.07.013

8. Elgin S.C.R., Reuter G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013;5(8):a017780. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a017780

9. FeichtingerJ., Hernández I., FischerC., Hanscho M., Auer N., Hackl M., Jadhav V., Baumann M., Krempl P.M., Schmidl C., Farlik M., Schuster M., Merkel A., Sommer A., Heath S., Rico D., Bock C., Thallinger G.G., Borth N. Comprehensive genome and epigenome characterization of CHO cells in response to evolutionary pressures and over time. Biotechnol. Bioeng. 2016;113(10):2241-2253. https://doi.org/10.1002/bit.25990

10. Fraser M.J., Ciszczon T., Elick T., Bauser C. Precise excision of TTAAspecific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol. Biol. 1996;5(2):141-151. https://doi.org/10.1111/j.1365-2583.1996.tb00048.x

11. Galvan D.L., Nakazawa Y., Kaja A., Kettlun C., Cooper L.J.N., Rooney C.M., Wilson M.H. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 2009;32(8):837-844. https://doi.org/10.1097/CJI.0b013e3181b2914c

12. Gierman H.J., Indemans M.H.G., Koster J., Goetze S., Seppen J., Geerts D., van Driel R., Versteeg R. Domain-wide regulation of gene expression in the human genome. Genome Res. 2007;17(9):1286-1295. https://doi.org/10.1101/gr.6276007

13. Gisler S., Gonçalves J.P., Akhtar W., de Jong J., Pindyurin A.V., Wessels L.F.A., van Lohuizen M. Multiplexed Cas9 targeting reveals genomic location effects and gRNA-based staggered breaks influencing mutation efficiency. Nat. Commun. 2019;10(1):1598. https://doi.org/10.1038/s41467-019-09551-w

14. Gupta K., Modi D., Jain R., Dandekar P. A stable CHO K1 cell line for producing recombinant monoclonal antibody against TNF-α. Mol. Biotechnol. 2021;63(9):828-839. https://doi.org/10.1007/s12033-021-00329-4

15. Huang X., Guo H., Tammana S., Jung Y.-C., Mellgren E., Bassi P., Cao Q., Tu Z.J., Kim Y.C., Ekker S.C., Wu X., Wang S.M., Zhou X. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol. Ther. 2010;18(10):1803-1813. https://doi.org/10.1038/mt.2010.141

16. Kim J.Y., Kim Y.-G., Lee G.M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012;93(3):917-930. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3758-5

17. Lalonde M.-E., Durocher Y. Therapeutic glycoprotein production in mammalian cells. J. Biotechnol. 2017;251:128-140. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2017.04.028

18. Lebedev M.O., Yarinich L.A., Ivankin A.V., Pindyurin A.V. Generation of barcoded plasmid libraries for massively parallel analysis of chromatin position effects. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2019;23(2):203-211. https://doi.org/10.18699/VJ19.483

19. Li M.A., Pettitt S.J., Eckert S., Ning Z., Rice S., Cadiñanos J., Yusa K., Conte N., Bradley A. The piggyBac transposon displays local and distant reintegration preferences and can cause mutations at noncanonical integration sites. Mol. Cell. Biol. 2013;33(7):1317-1330. https://doi.org/10.1128/MCB.00670-12

20. Orlova N.A., Kovnir S.V., Hodak J.A., Vorobiev I.I., Gabibov A.G., Skryabin K.G. Improved elongation factor-1 alpha-based vectors for stable high-level expression of heterologous proteins in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 2014;14:56. https://doi.org/10.1186/1472-6750-14-56

21. O’Shea J.P., Chou M.F., Quader S.A., Ryan J.K., Church G.M., Schwartz D. pLogo: a probabilistic approach to visualizing sequence motifs. Nat. Methods. 2013;10(12):1211-1212. https://doi.org/10.1038/nmeth.2646

22. Ritacco F.V., Wu Y., Khetan A. Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: history, key components, and optimization strategies. Biotechnol. Prog. 2018; 34(6):1407-1426. https://doi.org/10.1002/btpr.2706

23. Ruf S., Symmons O., Uslu V.V., Dolle D., Hot C., Ettwiller L., Spitz F. Large-scale analysis of the regulatory architecture of the mouse genome with a transposon-associated sensor. Nat. Genet. 2011;43(4): 379-386. https://doi.org/10.1038/ng.790

24. Running Deer J., Allison D.S. High-level expression of proteins in mammalian cells using transcription regulatory sequences from the Chinese hamster EF-1α gene. Biotechnol. Prog. 2004;20(3):880-889. https://doi.org/10.1021/bp034383r

25. Stach C.S., McCann M.G., O′Brien C.M., Le T.S., Somia N., Chen X., Lee K., Fu H.Y., Daoutidis P., Zhao L., Hu W.S., Smanski M. Modeldriven engineering of N-linked glycosylation in Chinese hamster ovary cells. ACS Synth. Biol. 2019;8(11):2524-2535. https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00215

26. Wang X., Xu Z., Tian Z., Zhang X., Xu D., Li Q., Zhang J., Wang T. The EF-1α promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells. J. Cell. Mol. Med. 2017;21(11):3044-3054. https://doi.org/10.1111/jcmm.13216

27. Wilson M.H., Coates C.J., George A.L., Jr. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol. Ther. 2007;15(1):139-145. https://doi.org/10.1038/sj.mt.6300028

28. Xu W.-J., Lin Y., Mi C.-L., Pang J.-Y., Wang T.-Y. Progress in fed-batch culture for recombinant protein production in CHO cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2023;107(4):1063-1075. https://doi.org/10.1007/s00253-022-12342-x