Универсальная панель STR-локусов для исследования полиморфизма вида Canis lupus и криминалистической идентификации собаки и волка

Коммерческие панели микросателлитных (STR) локусов предназначены для работы с ДНК собаки домашней (Canis lupus familiaris), в связи с чем при генотипировании волка обыкновенного (Canis lupus lupus) большинство маркеров показывают существенные отклонения от равновесия Харди–Вайнберга и имеют низкий показатель информативной ценности, что осложняет их использование в судебной экспертизе. Целью настоящего исследования стал подбор STR­-маркеров, которые одинаково эффективно отображают популяционный полиморфизм волка и собаки, с последующим созданием универсальной панели для дифференциации и идентификации особей волка и собаки в криминалистике. На основе исследования полиморфизма 34 STR­-локусов сконструирована панель CPlex из 15 аутосомных локусов и двух локусов половой принадлежности, которая одинаково применима для идентификации волка и собаки. Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) между выборками выявил достоверные значения дифференциации (F_ST = 0.0828, p < 0.05), что позволяет использовать панель для дифференциации образцов волка обыкновенного и собаки домашней. Впервые в судебной экспертизе объектов животного происхождения в Республике Беларусь рассчитаны коэффициенты подразделенности популяции (θ­-value) для каждого из 15 STR­-локусов разработанной тест­-системы. Показано, что значения частот генотипов, усредненные по всем исследованным животным без учета и с учетом θ-­value, различаются на три порядка (3.39 · 10^–17 и 4.71 · 10^–14 соответственно). Применение коэффициентов подразделенности популяции позволит оперировать наиболее достоверными результатами экспертного идентификационного исследования. Предложенная тест-система валидирована в соответствии с протоколом Scientific Working Group on DNA Analysis Methods. Создан информационно­-статистический комплекс для автоматизации обсчета генетических данных волка обыкновенного и собаки домашней в судебной экспертизе, утверждены две методики для практикующих судебных экспертов. Методические разработки успешно применяются в экспертной практике при расследовании фактов незаконной охоты, жестокого обращения с животными и других правонарушений в Республике Беларусь.

1. Aspi J., Roininen E., Ruokonen M., Kojola I., Vila C. Genetic diversity, population structure, effective population size and demographic history of the Finnish wolf population. Mol. Ecol. 2006;15(6):1561-1576. DOI 10.1111/j.1365-294X.2006.02877.x

2. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Sayers E.W. GenBank. Nucleic Acids Res. 2005;34:D16­D20. DOI 10.1093/nar/gkj157

3. Boitani L. Wolf Conservation and Recovery. Chicago: Univ. of Chicago Press, 2003;317-340

4. Boom R.C.J.A., Sol C.J., Salimans M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M., Van der Noordaa J.P.M.E. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990;28(3):495-503. DOI 10.1128/jcm.28.3.495­503.1990

5. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 1980;32(3):314

6. Buckleton J.S., Curran J.M., Walsh S.J. How reliable is the sub-population model in DNA testimony? Forensic Sci. Int. 2006;157(2-3): 144­148. DOI 10.1016/j.forsciint.2005.04.004

7. Buckleton J.S., Bright J.A., Taylor D. Forensic DNA Evidence Interpretation. CRC Press, 2016. DOI 10.4324/9781315371115

8. Caniglia R., Fabbri E., Greco C., Galaverni M., Randi E. Forensic DNA against wildlife poaching: identification of a serial wolf killing in Italy. Forensic Sci. Int. Genet. 2010;4(5):334­338. DOI 10.1016/j.fsigen.2009.10.012

9. Ðan M., Šnjegota D., Veličković N., Stefanović M., Obreht Vidaković D., Ćirović D. Genetic variability and population structure of grey wolf (Canis lupus) in Serbia. Russ. J. Genet. 2016;52(8):821-827. DOI 10.1134/S1022795416080044

10. DeNise S., Johnston E., Halverson J., Marshall K., Rosenfeld D., McKenn S., Sharp T., Edwards J. Power of exclusion for parentage verification and probability of match for identity in American kennel club breeds using 17 canine microsatellite markers. Anim. Genet. 2004;35(1):14-17. DOI 10.1046/j.1365-2052.2003.01074.x

11. Eichmann C., Berger B., Reinhold M., Lutz M., Parson W. Caninespecific STR typing of saliva traces on dog bite wounds. Int. J. Leg. Med. 2004;118(6):337-342. DOI 10.1007/s00414-004-0479-7

12. Evanno G., Regnaut S., Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Mol. Ecol. 2005;14(8):2611­2620. DOI 10.1111/j.1365­294X.2005.02553.x

13. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis. Evol. Bioinform. Online. 2005;1:47-50

14. Fan Z., Silva P., Gronau I., Wang S., Armero A.S., Schweizer R.M., Ramirez O., Pollinger J., Galaverni M., Ortega Del­Vecchyo D., Du L., Zhang W., Zhang Z., Xing J., Vilà C., Marques-Bonet T., Godinho R., Yue B., Wayne R.K. Worldwide patterns of genomic variation and admixture in gray wolves. Genome Res. 2016;26(2):163-173. DOI 10.1101/gr.197517.115

15. Freedman A.H., Wayne R.K. Deciphering the origin of dogs: from fossils to genomes. Annu. Rev. Anim. Biosci. 2017;5:281-307. DOI 10.1146/annurev-animal-022114-110937

16. Galinskayaa T.V., Schepetov D.M., Lysenkov S.N. Prejudices against microsatellite studies and how to resist them. Russ. J. Genet. 2019; 55(6):617-632. DOI 10.1134/S0016675819060043

17. Godinho R., Llaneza L., Blanco J.C., Lopes S., Alvares F., Garcia E.J., Palacios V., Cortés Y., Talegón J., Ferrand N. Genetic evidence for multiple events of hybridization between wolves and domestic dogs in the Iberian Peninsula. Mol. Ecol. 2011;20(24):5154­5166. DOI 10.1111/j.1365­294x.2011.05345.x

18. Hall T., Biosciences I., Carlsbad C.J.G.B.B. BioEdit: an important soft-ware for molecular biology. GERF Bull. Biosci. 2011;2(1):60­61 Halverson J., Basten C. A PCR multiplex and database for forensic DNA identification of dogs. J. Forensic Sci. 2005;50(2):352­363 Hedrick P.W. Genetics of Populations. Boston: Jones and Bartlett, 2000

19. Kalinowski S.T., Taper M.L., Marshall T.C. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Mol. Ecol. 2007;16(5):1099-1106. DOI 10.1111/j.1365-294x.2007.03089.x

20. Korablev M.P., Korablev N.P., Korablev P.N. Genetic diversity and population structure of the grey wolf (Canis lupus Linnaeus, 1758) and evidence of wolf × dog hybridisation in the centre of European Russia. Mamm. Biol. 2021;101(1):91-104. DOI 10.1007/s42991-020-00074-2

21. Magory Cohen T., King R., Dolev A., Boldo A., Lichter-Peled A., Kahila Bar­Gal G. Genetic characterization of populations of the golden jackal and the red fox in Israel. Conserv. Genet. 2013;14(1):55­63. DOI 10.1007/s10592-012-0423-1

22. Ministry of Forestry of the Republic of Belarus. Annual Forest Management Report. 2021 (in Russian)

23. Parker H.G., Dreger D.L., Rimbault M., Davis B.W., Mullen A.B., Carpintero­Ramirez G., Ostrander E.A. Genomic analyses reveal the influence of geographic origin, migration, and hybridization on modern dog breed development. Cell Rep. 2017;19(4):697-708. DOI 10.1016/j.celrep.2017.03.079

24. Peakall R.O.D., Smouse P.E. GenAlEx 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Mol. Ecol. Notes. 2006;6(1):288-295. DOI 10.1111/j.1471-8286.2005.01155.x

25. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Exel. Population genetic software for teaching and research – an update. Bioinformatics. 2012;28:2537-2539. DOI 10.1093/bioinformatics/bts460

26. Pritchard J.K., Stephens M., Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics. 2000;155(2):945-959. DOI 10.1093/genetics/155.2.945

27. Radko A., Podbielska A. Microsatellite DNA analysis of genetic diversity and parentage testing in the popular dog breeds in Poland. Genes. 2021;12(4):485. DOI 10.3390/genes12040485

28. Revised Validation Guideline – Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM). Forensic Sci. Commun. 2004;6(3). Available from: http://www.fbi.gov/about­us/lab/forensic­science-communications/fsc/july2004/standards/2004_03_standards02.htm

29. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain­terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977;74(12):5463-5467. DOI 10.1073/pnas.74.12.5463

30. Sastre N., Vila C., Salinas M., Bologov V.V., Urios V., Sánchez A., Francino O., Ramírez O. Signatures of demographic bottlenecks in European wolf populations. Conserv. Genet. 2011;12(3):701-712. DOI 10.1007/s10592-010-0177-6

31. Seddon J.M. Canid-specific primers for molecular sexing using tissue or non­invasive samples. Conserv. Genet. 2005;6(1):147-149. DOI 10.1007/s10592-004-7734-9

32. Stronen A.V., Aspi J., Caniglia R., Fabbri E., Galaverni M., Godinho R., Kvist L., Mattucci F., Nowak C., von Thaden A., Harmoinen J. Wolfdog admixture highlights the need for methodological standards and multidisciplinary cooperation for effective governance of wild × domestic hybrids. Biol. Conserv. 2022;266:109467. DOI 10.1016/j.biocon.2022.109467

33. The Evaluation of Forensic DNA Evidence / Committee on DNA Forensic Science: an Update. National Research Council. Washington D.C.: National Academy Press, 1996

34. van Asch B., Alves C., Santos L., Pinheiro R., Pereira F., Gusmao L., Amorim A. Genetic profiles and sex identification of found-dead wolves determined by the use of an 11­loci PCR multiplex. Forensic Sci. Int. Genet. 2010;4(2):68-72. DOI 10.1016/j.fsigen.2009.05.003

35. van Oosterhout C., Hutchinson W.F., Wills D.P., Shipley P. MICROCHECKER: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Mol. Ecol. Notes. 2004;4(3):535­538. DOI 10.1111/j.1471-8286.2004.00684.x

36. Verardi A., Lucchini V., Randi E. Detecting introgressive hybridization between free­ranging domestic dogs and wild wolves (Canis lupus) by admixture linkage disequilibrium analysis. Mol. Ecol. 2006; 15(10):2845­2855. DOI 10.1111/j.1365­294X.2006.02995.x

37. Wright S. Variability Within and Among Natural Populations. Evolution and the Genetics of Populations. Chicago: Univ. of Chicago Press, 1978