Сравнение различных сочетаний криопротекторов и методов оттаивания при криоконсервации эмбрионов мышей и крыс

Выбор криопротектора, способа оттаивания эмбрионов влияет на эффективность процесса криоконсервации. Cпособ замораживания и оттаивания эмбрионов, нацеленный на сохраение бластомеров, был подобран на мышах линии ICR. В работе получали эмбрионы мышей линии ICR, а также крыс линий GC и OXYS на стадии дробящихся зародышей на третий день после спаривания и производили их замораживание по стандартной программе в пластиковых соломинах. На мышах ICR cравнивали влияние проникающих (этиленгликоль, глицерин) и не проникающих (сахароза) криопротекторов в их комбинации на выживание эмбрионов после замораживания. В этом же эксперименте сравнивали более быстрый (10 с на водяной бане при 37 °С) и более медленный (40 с при комнатной температуре, затем 40 с на водяной бане при 30 °С) способы оттаивания зародышей. Жизнеспособность эмбрионов мышей и крыс после процедур криоконсервации оценивалась путем их культивирования in vitro. Наши данные, полученные на мышах, свидетельствуют о том, что «медленное» оттаивание лучше подходит для выживания эмбрионов, чем «быстрое» оттаива- ние; добавление сахарозы к основному криопротектору (этиленгликолю или глицерину) улучшает показатели развития эмбрионов in vitro после оттаивания, особенно когда криопротектором является глицерин. Именно этот способ замораживания–оттаивания эмбрионов (глицерин с сахарозой в качестве криопротекторов, «медленное» оттаивание) был использован при работе с крысами линий GC и OXYS, при этом 68–83,3 % всех зародышей успешно пережили криоконсервацию, из них 64,7–66,6 % – успешно развивались в культуре.

мыши ICR, крысы GC, OXYS, криоконсервация эмбрионов, этиленгликоль, глицерин, сахароза

1. Амстиславский С.Я. Эмбриотехнологические подходы к сохранению исчезающих видов млекопитающих. Дис. … д-ра биол. наук. Новосибирск, 2006.

2. Амстиславский С.Я., Игонина Т.Н., Рожкова И.Н., Брусенцев Е.Ю., Роговая А.А., Рагаева Д.С., Напримеров В.А., Литвинова Е.А., Плюснина И.Ф., Маркель А.Л. Редеривация путем трансплантации эмбрионов линий лабораторных мышей и крыс. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013;17(1):147-161.

3. Брусенцев Е.Ю., Напримеров В.А., Амстиславский С.Я. Редеривация как способ очистки лабораторных животных. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011;15(1):102-113.

4. Рожкова И.Н., Брусенцев Е.Ю., Амстиславский С.Я. Оболочки преимплантационных зародышей млекопитающих как мишень репродуктивных технологий. Онтогенез. 2012;43(5):1-11.

5. Abbott A. Geneticists prepare for deluge of mutant mice. Nature. 2004; 432:541. DOI: 10.1038/432541a

6. Amstislavsky S., Brusentsev E., Kizilova E., Igonina T., Abramova T., Rozhkova I. Embryo cryopreservation and in vitro culture of preimplantation embryos in Campbell’s hamster (Phodopus campbelli). Theriogenology. 2015; 82:1056-1063. DOI: 10.1016/j.therigen logy.2014.12.013

7. Emiliani S., Van den Bergh M., Vannin A.S., Biramanel J., Englert Y. Comparison of ethylene glycol, 1,2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes, 4-cell embryos and blastocysts. Hum. Reprod. 2000;4:905-910. DOI: 10.1093/hum-rep/15.4.905

8. Lasar J., Moreno C., Jacob H., Kwitek A. Impact of genomics on research in rats. Genome Res. 2005;15: 1717- 1728. DOI: 10.1101/gr.3744005

9. McWilliams R.B., Gibbons W., Leibo S. Osmotic and physiological responses of mouse zygotes and human oocytes to mono- and disac-charides. Hum. Reprod. 1995;10:1163- 1171. DOI: 10.5.1163

10. Miyoshi K., Abeydeera L.R., Okuda K., Niwa K. Effects of osmolarity and amino acids in a chemically defined medium on development of rat one-cell embryos. J. Reprod. Fertil. 1995;103(1):27-32. DOI: 10.1530/jrf.0.1030027

11. Morrell J.M. Techniques of embryo transfer and facility decontamination used to improve the health and welfare of transgenic mice. Lab. Anim. 1999;33:201-206. DOI: 10.1258/002367799780578165

12. Pedro P.B., Yokoyama E., Zhu S.E., Yoshida N., Valdez D.M. Jr., Tanaka M., Edashige K., Kasai M. Permeability of mouse oocytes and embryos at various developmental stages to five cryoprotectants. J. Reprod. Dev. 2005;2:235-246. DOI: 10.1262/jrd.16079

13. Pfaff R.T., Agca Y., Liu J., Woods E.J., Peter A.T., Critser J.K. Cryobiology of rat embryos I: determination of zygote membrane permeability coefficients for water and cryoprotectants, their activation energies, and the development of improved cryopreservation methods. Biol. Reprod. 2000;63: 1294-1 DOI: 10.1095/biolreprod63.5.1294

14. Rall W.F., Schmidt P.M., Lin X., Brown S.S., Ward A.C., Hansen C.T. Factors affecting the efficiency of embryo cryopreservation and rederivation of rat and mouse models. ILAR J. 2000;41:221-227. DOI: 10.1093/ilar.41.4.221

15. Renard J.P., Babinet C. High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant. J. Exp. Zool. 1984;230:443-448. DOI: 10.1002/jez.1402300313

16. Ridha M.T., Dukelow W.R. The developmental potential of frozenthawed hamster preimplantation embryos following embryo transfer: viability of slowly frozen embryos following slow and rapid thawing. Anim. Reprod. Sci. 1985;9:253-29. DOI: 10.1016/03784320(85)90008-9

17. Rulicke T., Autenried P. Potential of two-cell mouse embryos to develop to term despite partial damage after cryopreservation. Lab. Anim. 1995;29:320-326. DOI: 10.1258/002367795781088252

18. Van Soom A., Wrathall A.E., Herrler A., Nauwynck H.J. Is the zona pellucida an efficient barrier to viral infection? Reprod. Fertil. Dev. 2010;22:21-31. DOI: 10.1071/RD D0923