Preview

Вавиловский журнал генетики и селекции

Расширенный поиск

Влияние ауксин-зависимой деградации когезина и конденсинов на репарацию двуцепочечных разрывов ДНК в эмбриональных стволовых клетках мыши

https://doi.org/10.18699/vjgb-24-65

Аннотация

Семейство SMC-белков, включающее когезин и конденсины I/II, играет ключевую роль в формировании топологической структуры хромосом и косвенно влияет на широкий спектр клеточных процессов, в том числе и на репарацию двуцепочечных разрывов ДНК (DSB). Комплекс когезина регулирует репарацию DSB на нескольких уровнях, например, распространяя сигнал γH2AX и удерживая концы ДНК в непосредственной близости за счет экструзии петель возле разрыва. Когезин также скрепляет сестринские хроматиды во время фазы S/G2, что ограничивает потенциальную подвижность концов ДНК. По имеющимся данным, в фибробластах человека нокдаун когезина стимулирует образование геномных делеций между удаленными DSB (3.2 тыс. п.о.), но не влияет на репарацию одиночных или близких DSB (34 п.о.). Мы решили проверить это наблюдение на эмбриональных стволовых клетках мыши, несущих ауксин-индуцибельный дегрон Rad21 (субъединица когезина) или Smc2 (субъединица конденсинов I+II). Для этого мы использовали нуклеофекцию RNP Cas9 и пары гайдовых РНК для генерации делеций и инверсий с высокой эффективностью без дополнительной селекции. Мы определили оптимальные условия для эффективной электропорации, включая настройки Neon, а также тайминги появления делеций. Были протестированы две стратегии добавления ауксина (суммарно четыре независимых эксперимента). Были исследованы частоты перестроек в двух сайтах размером около 3.5 и 3.9 тыс. п.о. Вопреки ожиданиям, деплеция Rad21 не увеличивала частоту делеций/инверсий, даже для региона с активной границей Ctcf. Фактически наблюдалось снижение частоты делеций (но не инверсий) на 12 %. Деплеция Smc2 не приводила к заметному увеличению частот делеций/инверсий, возможно, из-за высокой биологической изменчивости между экспериментами. Анализ TIDE показал, что частота редактирования была постоянной для большинства экспериментов (30–50 %), с незначительным снижением после добавления ауксина. В статье также обсуждается применимость метода Neon/ddPCR для создания и детекции делеций в эмбриональных стволовых клетках мыши.

Просмотров: 629


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2500-3259 (Online)