Влияние ауксин-зависимой деградации когезина и конденсинов на репарацию двуцепочечных разрывов ДНК в эмбриональных стволовых клетках мыши

Семейство SMC-белков, включающее когезин и конденсины I/II, играет ключевую роль в формировании топологической структуры хромосом и косвенно влияет на широкий спектр клеточных процессов, в том числе и на репарацию двуцепочечных разрывов ДНК (DSB). Комплекс когезина регулирует репарацию DSB на нескольких уровнях, например, распространяя сигнал γH2AX и удерживая концы ДНК в непосредственной близости за счет экструзии петель возле разрыва. Когезин также скрепляет сестринские хроматиды во время фазы S/G2, что ограничивает потенциальную подвижность концов ДНК. По имеющимся данным, в фибробластах человека нокдаун когезина стимулирует образование геномных делеций между удаленными DSB (3.2 тыс. п.о.), но не влияет на репарацию одиночных или близких DSB (34 п.о.). Мы решили проверить это наблюдение на эмбриональных стволовых клетках мыши, несущих ауксин-индуцибельный дегрон Rad21 (субъединица когезина) или Smc2 (субъединица конденсинов I+II). Для этого мы использовали нуклеофекцию RNP Cas9 и пары гайдовых РНК для генерации делеций и инверсий с высокой эффективностью без дополнительной селекции. Мы определили оптимальные условия для эффективной электропорации, включая настройки Neon, а также тайминги появления делеций. Были протестированы две стратегии добавления ауксина (суммарно четыре независимых эксперимента). Были исследованы частоты перестроек в двух сайтах размером около 3.5 и 3.9 тыс. п.о. Вопреки ожиданиям, деплеция Rad21 не увеличивала частоту делеций/инверсий, даже для региона с активной границей Ctcf. Фактически наблюдалось снижение частоты делеций (но не инверсий) на 12 %. Деплеция Smc2 не приводила к заметному увеличению частот делеций/инверсий, возможно, из-за высокой биологической изменчивости между экспериментами. Анализ TIDE показал, что частота редактирования была постоянной для большинства экспериментов (30–50 %), с незначительным снижением после добавления ауксина. В статье также обсуждается применимость метода Neon/ddPCR для создания и детекции делеций в эмбриональных стволовых клетках мыши.

1. Arnould C., Rocher V., Finoux A.-L., Clouaire T., Li K., Zhou F., Caron P., Mangeot P.E., Ricci E.P., Mourad R., Haber J.E., Noordermeer D., Legube G. Loop extrusion as a mechanism for formation of DNA damage repair foci. Nature. 2021;590(7847):660-665. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03193-z

2. Arnould C., Rocher V., Saur F., Bader A.S., Muzzopappa F., Collins S., Lesage E., Le Bozec B., Puget N., Clouaire T., Mangeat T., Mourad R., Ahituv N., Noordermeer D., Erdel F., Bushell M., Marnef A., Legube G. Chromatin compartmentalization regulates the response to DNA damage. Nature. 2023;623(7985):183-192. https://doi.org/10.1038/s41586-023-06635-y

3. Aymard F., Bugler B., Schmidt C.K., Guillou E., Caron P., Briois S., Iacovoni J.S., Daburon V., Miller K.M., Jackson S.P., Legube G. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struct. Mol. Biol. 2014; 21(4):366-374. https://doi.org/10.1038/nsmb.2796

4. Baergen A.K., Jeusset L.M., Lichtensztejn Z., McManus K.J. Diminished condensin gene expression drives chromosome instability that may contribute to colorectal cancer pathogenesis. Cancers (Basel ). 2019;11(8):1066. https://doi.org/10.3390/cancers11081066

5. Brinkman E.K., Chen T., Amendola M., van Steensel B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 2014;42(22):e168. https://doi.org/10.1093/nar/gku936

6. Brinkman E.K., Chen T., de Haas M., Holland H.A., Akhtar W., van Steensel B. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Mol. Cell. 2018;70(5):801-813.e6. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.04.016

7. Canver M.C., Bauer D.E., Dass A., Yien Y.Y., Chung J., Masuda T., Maeda T., Paw B.H., Orkin S.H. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J. Biol. Chem. 2014;289(31):21312-21324. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.564625

8. Chang H.-Y., Lee C.-Y., Lu C.-H., Lee W., Yang H.-L., Yeh H.-Y., Li H.-W., Chi P. Microcephaly family protein MCPH1 stabilizes RAD51 filaments. Nucleic Acids Res. 2020;48(16):9135-9146. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa636

9. Chenouard V., Leray I., Tesson L., Remy S., Allan A., Archer D., Caulder A., Fortun A., Bernardeau K., Cherifi Y., Teboul L., David L., Anegon I. Excess of guide RNA reduces knockin efficiency and drastically increases on-target large deletions. iScience. 2023;26(4): 106399. https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.106399

10. Choi E.-H., Yoon S., Park K.-S., Kim K.P. The homologous recombination machinery orchestrates post-replication DNA repair during self-renewal of mouse embryonic stem cells. Sci. Rep. 2017;7(1): 11610. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11951-1

11. Dobbs F.M., van Eijk P., Fellows M.D., Loiacono L., Nitsch R., Reed S.H. Precision digital mapping of endogenous and induced genomic DNA breaks by INDUCE-seq. Nat. Commun. 2022;13(1): 3989. https://doi.org/10.1038/s41467-022-31702-9

12. Dyson S., Segura J., Martínez-García B., Valdés A., Roca J. Condensin minimizes topoisomerase II-mediated entanglements of DNA in vivo. EMBO J. 2021;40(1):e105393. https://doi.org/10.15252/embj.2020105393

13. Gelot C., Guirouilh-Barbat J., Le Guen T., Dardillac E., Chailleux C., Canitrot Y., Lopez B.S. The cohesin complex prevents the end joining of distant DNA double-strand ends. Mol. Cell. 2016;61(1): 15-26. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.11.002

14. Houlard M., Cutts E.E., Shamim M.S., Godwin J., Weisz D., Presser Aiden A., Lieberman Aiden E., Schermelleh L., Vannini A., Nasmyth K. MCPH1 inhibits condensin II during interphase by regulating its SMC2-Kleisin interface. eLife. 2021;10:e73348. https://doi.org/10.7554/eLife.73348

15. Jones S.K., Hawkins J.A., Johnson N.V., Jung C., Hu K., Rybarski J.R., Chen J.S., Doudna J.A., Press W.H., Finkelstein I.J. Massively parallel kinetic profiling of natural and engineered CRISPR nucleases. Nat. Biotechnol. 2021;39(1):84-93. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0646-5

16. Kabirova E., Nurislamov A., Shadskiy A., Smirnov A., Popov A., Salnikov P., Battulin N., Fishman V. Function and evolution of the loop extrusion machinery in animals. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(5):5017. https://doi.org/10.3390/ijms24055017

17. Kim S., Kim D., Cho S.W., Kim J., Kim J.-S. Highly efficient RNAguided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-1019. https://doi.org/10.1101/gr.171322.113

18. Li D., Sun X., Yu F., Perle M.A., Araten D., Boeke J.D. Application of counter-selectable marker PIGA in engineering designer deletion cell lines and characterization of CRISPR deletion efficiency. Nucleic Acids Res. 2021;49(5):2642-2654. https://doi.org/10.1093/nar/gkab035

19. Minchell N.E., Keszthelyi A., Baxter J. Cohesin causes replicative DNA damage by trapping DNA topological stress. Mol. Cell. 2020; 78(4):739-751.e8. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.03.013

20. Piazza A., Bordelet H., Dumont A., Thierry A., Savocco J., Girard F., Koszul R. Cohesin regulates homology search during recombinational DNA repair. Nat. Cell Biol. 2021;23(11):1176-1186. https://doi.org/10.1038/s41556-021-00783-x

21. Schimmel J., Kool H., van Schendel R., Tijsterman M. Mutational signatures of non-homologous and polymerase theta-mediated endjoining in embryonic stem cells. EMBO J. 2017;36(24):3634-3649. https://doi.org/10.15252/embj.201796948

22. Schwarzer W., Abdennur N., Goloborodko A., Pekowska A., Fudenberg G., Loe-Mie Y., Fonseca N.A., Huber W., Haering C.H., Mirny L., Spitz F. Two independent modes of chromatin organization revealed by cohesin removal. Nature. 2017;551(7678):51-56. https://doi.org/10.1038/nature24281

23. Stephenson A.A., Raper A.T., Suo Z. Bidirectional degradation of DNA cleavage products catalyzed by CRISPR/Cas9. J. Am. Chem. Soc. 2018;140(10):3743-3750. https://doi.org/10.1021/jacs.7b13050

24. Ström L., Lindroos H.B., Shirahige K., Sjögren C. Postreplicative recruitment of cohesin to double-strand breaks is required for DNA repair. Mol. Cell. 2004;16(6):1003-1015. https://doi.org/10.1016/j.molcel. 2004.11.026

25. Ünal E., Arbel-Eden A., Sattler U., Shroff R., Lichten M., Haber J.E., Koshland D. DNA damage response pathway uses histone modification to assemble a double-strand break-specific cohesin domain. Mol. Cell. 2004;16(6):991-1002. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2004.11.027

26. Watry H.L., Feliciano C.M., Gjoni K., Takahashi G., Miyaoka Y., Conklin B.R., Judge L.M. Rapid, precise quantification of large DNA excisions and inversions by ddPCR. Sci. Rep. 2020;10(1):14896. https://doi.org/10.1038/s41598-020-71742-z

27. Wood J.L., Liang Y., Li K., Chen J. Microcephalin/MCPH1 associates with the Condensin II complex to function in homologous recombination repair. J. Biol. Chem. 2008;283(43):29586-29592. https://doi.org/10.1074/jbc.M804080200

28. Wu N., Yu H. The Smc complexes in DNA damage response. Cell Biosci. 2012;2(1):5. https://doi.org/10.1186/2045-3701-2-5

29. Wu X., Mondal G., Wang X., Wu J., Yang L., Pankratz V.S., Rowley M., Couch F.J. Microcephalin regulates BRCA2 and Rad51-associated DNA double-strand break repair. Cancer Res. 2009;69(13):5531- 5536. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-4834

30. Yunusova A., Smirnov A., Shnaider T., Lukyanchikova V., Afonnikova S., Battulin N. Evaluation of the OsTIR1 and AtAFB2 AID systems for genome architectural protein degradation in mammalian cells. Front. Mol. Biosci. 2021;8:757394. https://doi.org/10.3389/fmolb.2021. 757394