Получение и характеристика двойной нокаутной линии Arabidopsis thaliana, лишенной экспрессии АOX1а и VTC2

У высших растений L-галактозный путь является основным путем биосинтеза витамина С (аскорбата, Аск), последний этап которого связан с функционированием электрон-транспортной цепи митохондрий. Помимо основного цитохромного пути, электрон-транспортная цепь растений содержит альтернативный путь через альтернативную терминальную оксидазу (АОХ). Вовлечение АОХ способствует синтезу Аск, поэтому предполагается, что подавление альтернативного пути в условиях дефицита Аск может привести к снижению жизнеспособности растений. В связи с этим была поставлена цель – рассмотреть последствия нокаутирования в растениях Arabidopsis thaliana одновременно двух генов: АОХ1а, наиболее стресс-индуцибельного гена АОХ, и VTC2, гена ключевого фермента L-галактозного пути синтеза Аск. Для этого проведено скрещивание двух линий A. thaliana с Т-ДНК инсерцией в целевых генах и получены гибридные линии. Изучены характеристики семян первого (F₁) и второго (F₂) поколений. Семена F₁ отличались более крупными размерами по сравнению с родительскими линиями, что могло быть следствием гетерозиса. В поколении F₂ в результате самоопыления растений F₁ сформировались семена, значительно варьирующие по размерам, в том числе группа мелких семян, имеющих дегенеративные морфологические отклонения. Большинство мелких семян не прорастало или погибало на стадии появления проростка. Генотипирование этих семян с помощью ПЦР установило отсутствие нормальных копий АОХ1а и VTC2 в геноме, что указывает на появление летальной мутации при одновременном нокауте обоих генов. Обсуждаются причины летального исхода двойного нокаута. Одной из генетических причин, по-видимому, стало взаимодействие мутаций (неаллельных генов). На физиологическом уровне, возможно, возникли необратимые нарушения дыхания, в том числе из-за влияния в линии vtc2 криптической мутации. Для подтверждения данных гипотез требуются дальнейшие исследования. В целом полученные результаты свидетельствуют о жизненно важном совместном функционировании альтернативного и L-галактозного путей биосинтеза Аск и могут быть полезны для развития генно-инженерных приемов управления синтезом витамина С в растениях.

1. Bartoli C.G., Yu J., Gómez F., Fernández L., McIntosh L., Foyer C.H. Inter-relationships between light and respiration in the control of ascorbic acid synthesis and accumulation in Arabidopsis thaliana leaves. J Exp Bot. 2006;57(8):1621-1631. doi 10.1093/jxb/erl005

2. Belykh E., Yadrikhinskiy K., Golubev M., Belykh N., Velegzhaninov I., Garmash E. Localization data of the T-DNA insertion site in Arabidopsis line SALK_146824C. Data Brief. 2024;54:110309. doi 10.1016/j.dib.2024.110309

3. Boyes D.C., Zayed A.M., Ascenzi R., McCaskill A.J., Hoffman N.E., Davis K.R., Görlach J. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 2001;13(7):1499-1510. doi 10.2307/3871382

4. Conklin P.L., Williams E.H., Last R.L. Environmental stress sensitivity of an ascorbic acid-deficient Arabidopsis mutant. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(18):9970-9974. doi 10.1073/pnas.93.18.9970

5. Czechowski T., Stitt M., Altmann T., Udvardi M.K., Scheible W.-R. Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 2005; 139(1):5-17. doi 10.1104/pp.105.063743

6. Del-Saz N.F., Ribas-Carbo M., McDonald A.E., Lambers H., Fernie A.R., Florez-Sarasa I. An in vivo perspective of the role(s) of the alternative oxidase pathway. Trends Plant Sci. 2018;23(3):206-219. doi 10.1016/j.tplants.2017.11.006

7. Dowdle J., Ishikawa T., Gatzek S., Rolinski S., Smirnoff N. Two genes in Arabidopsis thaliana encoding GDP-L-galactose phosphorylase are required for ascorbate biosynthesis and seedling viability. Plant J. 2007;52(4):673-689. doi 10.1111/j.1365-313X.2007.03266.x

8. Ederli L., Morettini R., Borgogni A., Wasternack C., Miersch O., Reale L., Ferranti F., Tosti N., Pasqualini S. Interaction between nitric oxide and ethylene in the induction of alternative oxidase in ozone-treated tobacco plants. Plant Physiol. 2006;142(2):595-608. doi 10.1104/pp.106.085472

9. Foyer C.H., Kyndt T., Hancock R.D. Vitamin C in plants: novel concepts, new perspectives, and outstanding issues. Antioxid Redox Signal. 2020;32(7):463-485. doi 10.1089/ars.2019.7819

10. Garmash E.V. Signaling pathways of alternative oxidase genes expression in plants. Russ J Plant Physiol. 2022;69(1):1. doi 10.1134/S1021443722010058

11. Garmash E.V. Suppression of mitochondrial alternative oxidase can result in upregulation of the ROS scavenging network: some possible mechanisms underlying the compensation effect. Plant Biol. 2023; 25(1):43-53. doi 10.1111/plb.13477

12. Garmash E.V., Dymova O.V., Silina E.V., Malyshev R.V., Belykh E.S., Shelyakin M.A., Velegzhaninov I.O. AOX1a expression in Arabidopsis thaliana affects the state of chloroplast photoprotective systems under moderately high light conditions. Plants (Basel). 2022; 11(22):3030. doi 10.3390/plants11223030

13. Garmash E.V., Silina E.V., Belykh E.S., Shelyakin M.A., Malyshev R.V. Alternative oxidase affects ascorbate metabolism in Arabidopsis thaliana plants under high-light conditions: possible links between respiratory electron transport pathways in mitochondria. J Biosci. 2024;49:94. doi 10.1007/s12038-024-00471-6

14. Giacomelli L., Masi A., Ripoll D.R., Lee M.J., van Wijk K.J. Arabidopsis thaliana deficient in two chloroplast ascorbate peroxidases shows accelerated light-induced necrosis when levels of cellular ascorbate are low. Plant Mol Biol. 2007;65:627-644. doi 10.1007/s11103-007-9227-y

15. Jander G., Norris S.R., Rounsley S.D., Bush D.F., Levin I.M., Last R.L. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 2002;129(2):440-450. doi 10.1104/pp.003533

16. Kerchev P.I., Pellny T.K., Vivancos P.D., Kiddle G., Hedden P., Driscoll S., Vanacker H., Verrier P., Hancock R.D., Foyer C.H. The transcription factor ABI4 is required for the ascorbic acid-dependent regulation of growth and regulation of jasmonate-dependent defense signaling pathways in Arabidopsis. Plant Cell. 2011;23(9):3319-3334. doi 10.1105/tpc.111.090100

17. Lim B., Smirnoff N., Cobbett C.S., Golz J.F. Ascorbate-deficient vtc2 mutants in Arabidopsis do not exhibit decreased growth. Front Plant Sci. 2016;7:1025. doi 10.3389/fpls.2016.01025

18. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-408. doi 10.1006/meth.2001.1262

19. Matos I.F., Morales L.M.M., Santana D.B., Silva G.M.C., Gomes M.M.A., Ayub R.A., Costa J.H., de Oliveira J.G. Ascorbate synthesis as an alternative electron source for mitochondrial respiration: possible implications for the plant performance. Front Plant Sci. 2022;13: 987077. doi 10.3389/fpls.2022.987077

20. Müller-Moulé P., Golan T., Niyogi K.K. Ascorbate-deficient mutants of Arabidopsis grow in high light despite chronic photooxidative stress. Plant Physiol. 2004;134(3):1163-1172. doi 10.1104/pp.103.032375

21. Pasqualini S., Paolocci F., Borgogni A., Morettini R., Ederli L. The overexpression of an alternative oxidase gene triggers ozone sensitivity in tobacco plants. Plant Cell Environ. 2007;30(12):1545-1556. doi 10.1111/j.1365-3040.2007.01730.x

22. Smirnoff N. Ascorbic acid metabolism and functions: a comparison of plants and mammals. Free Radic Biol Med. 2018;122:116-129. doi 10.1016/j.freeradbiomed.2018.03.033

23. Sweetman C., Waterman C.D., Wong D.C.J., Day D.A., Jenkins C.L.D., Soole K.L. Altering the balance between AOX1A and NDB2 expression affects a common set of transcripts in Arabidopsis. Front Plant Sci. 2022;13:876843. doi 10.3389/fpls.2022.876843

24. Talla S., Riazunnisa K., Padmavathi L., Sunil B., Rajsheel P., Raghavendra A.S. Ascorbic acid is a key participant during the interactions between chloroplasts and mitochondria to optimize photosynthesis and protect against photoinhibition. J Biosci. 2011;36:163-173. doi 10.1007/s12038-011-9000-x

25. Van Aken O. Mitochondrial redox systems as central hubs in plant metabolism and signaling. Plant Physiol. 2021;186(1):36-52. doi 10.1093/plphys/kiab101

26. Vanlerberghe G.C., Dahal K., Alber N.A., Chadee A. Photosynthesis, respiration and growth: a carbon and energy balancing act for alternative oxidase. Mitochondrion. 2020;52:197-211. doi 10.1016/j.mito.2020.04.001

27. Vishwakarma A., Tetali S.D., Selinski J., Scheibe R., Padmasree K. Importance of the alternative oxidase (AOX) pathway in regulating cellular redox and ROS homeostasis to optimize photosynthesis during restriction of the cytochrome oxidase pathway in Arabidopsis thaliana. Ann Bot. 2015:116(4):555-569. doi 10.1093/aob/mcv122

28. Wheeler G., Ishikawa T., Pornsaksit V., Smirnoff N. Evolution of alternative biosynthetic pathways for vitamin C following plastid acquisition in photosynthetic eukaryotes. eLife. 2015:13(4):e06369. doi 10.7554/eLife.06369

29. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T.L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 2012;13:134. doi 10.1186/1471-2105-13-134

30. Yoshimura K., Nakane T., Kume S., Shiomi Y., Maruta T., Ishikawa T., Shigeoka S. Transient expression analysis revealed the importance of VTC2 expression level in light/dark regulation of ascorbate biosynthesis in Arabidopsis. Biosci Biotechnol Biochem. 2014;78(1): 60-66. doi 10.1080/09168451.2014.877831

31. Zhu Y., Du B., Qian J., Zou B., Hua J. Disease resistance gene-induced growth inhibition is enhanced by rcd1 independent of defence activation in Arabidopsis. Plant Physiol. 2013;161(4):2005-2013. doi 10.1104/pp.112.213363