Сделать сложное проще: современный инструментарий для редактирования генома растений

Существует несколько технологий редактирования генома растений, из которых наиболее простой и универсальной является CRISPR/Cas. В настоящее время эта технология активно используется для нокаутирования генов, делеций участков генома и встраивания экзогенных последовательностей в растительный геном. Для каждого из этих приложений разработано множество вариантов генетического инструментария, которые использовались раз- личными исследовательскими группами для решения конкретных задач. Технология CRISPR/Cas применительно к редактированию генома растений находится на начальном этапе оптимизации, выражающейся в поиске наиболее эффективных, простых и универсальных методик. Вследствие этого экспериментальная работа должна предваряться достаточно длительным и трудоемким выбором варианта генетического инструментария, оптимального для решения конкретной экспериментальной задачи. В данном обзоре мы охарактеризовали разработанные на сегодняшний день основные варианты генетического инструментария технологии CRISPR/Cas для редактирования генома растений с точки зрения решаемых экспериментальных задач, составляющих компонентов и эффективности применения. В первой части подробно рассмотрены основные элементы технологии CRISPR/Cas – нуклеаза и направляющая РНК, проанализировано влияние структурных особенностей этих элементов на эффективность редактирования. Обобщены экспериментальные данные о взаимосвязи между эффективностью редактирования и нуклеотидной последовательностью направляющей РНК. Охарактеризованы различные варианты нуклеаз, использовавшиеся при редактировании геномов растений, обсуждаются преимущества этих вариантов для решения определенных экспериментальных задач. Вторая часть обзора посвящена различным стратегиям экспрессии элементов системы CRISPR/Cas в растительных клетках, в частности преимуществам и недостаткам использования стабильной трансформации и транзиентной экспрессии. Описывается влияние регуляторных элементов генов, кодирующих нуклеазу и направляющую РНК, на эффективность редактирования. Особый акцент сделан на способах повышения эффективности замещения целевых участков в гене растений на экзогенные последовательности ДНК.

CRISPR/Cas, редактирование генома, генетическая инженерия растений, sgRNA

1. Andersson M., Turesson H., Nicolia A., Fält A.S., Samuelsson M., Hofvander P. Efficient targeted multiallelic mutagenesis in tetraploid potato (Solanum tuberosum) by transient CRISPR-Cas9 expression in protoplasts. Plant Cell Reports. 2016;1-12. DOI 10.1007/s00299016-2062-3.

2. Baltes N.J., Gil-Humanes J., Cermak T., Atkins P.A., Voytas D.F. DNA replicons for plant genome engineering. Plant Cell. 2014;26(1):151163. DOI 10.1105/tpc.113.119792.

3. Bortesi L., Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol. Advances. 2015;33(1):41-52. DOI 10.1016/j.biotechadv.2014.12.006.

4. Butler N.M., Baltes N.J., Voytas D.F., Douches D.S. Geminivirusmediated genome editing in potato (Solanum tuberosum L.) using sequence-specific nucleases. Front. Plant Sci. 2016;7:1045. DOI 10.3389/fpls.2016.01045.

5. Čermák T., Baltes N.J., Čegan R., Zhang Y., Voytas D.F. High-frequency, precise modification of the tomato genome. Genome Biology. 2015;16(1):1. DOI 10.1186/s13059-015-0796-9.

6. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819823. DOI 10.1126/science.1231143.

7. Chugunova A A., Dontsova O.A., Sergiev P.V. Methods of genome engineering: a new era of molecular biology. Biomeditsinskaya Khimiya = Biomedical Chemistry (Moscow). 2016;81(7):662-677. DOI 10.1134/S0006297916070038. (in Russian)

8. Ding Y., Li H., Chen L.L., Xie K. Recent advances in genome editing using CRISPR/Cas9. Front. Plant Sci. 2016;7:703. DOI 10.3389/fpls.2016.00703.

9. Endo M., Mikami M., Toki S. Multi-gene knockout utilizing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice. Plant Cell Physiol. 2014;56(1):41-47. DOI 10.1093/pcp/pcu154.

10. Fauser F., Roth N., Pacher M., Ilg G., Sánchez-Fernández R., Biesgen C., Puchta H. In planta gene targeting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012;109(19):7535-7540. DOI 10.1073/pnas.1202191109.

11. Fauser F., Schiml S., Puchta H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. PlantJ. 2014;79(2):348-359. DOI 10.1111/tpj.12554.

12. Fonfara I., Le Rhun A., Chylinski K., Makarova K.S., Lécrivain A.L., Bzdrenga J., Koonin E.V., Charpentier E. Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucl. Acids Res. 2014; 42(4):2577-2590. DOI 10.1093/nar/gkt1074.

13. Fu Y., Sander J.D., Reyon D., Cascio V.M., Joung J.K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnol. 2014;32(3):279-284. DOI 10.1038/nbt.2808.

14. Gagnon J.A., Valen E., Thyme S.B., Huang P., Ahkmetova L., Pauli A., Montague T.G., Zimmerman S., Richter C., Schier A.F. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS ONE. 2014; 9(5):e98186. DOI 10.1371/journal.pone.0098186.

15. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V., Li Y., Fine E.J., Wu X., Shalem O., Cradick T.J., Marraffini L.A., Bao G., Zhang F. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 2013;31(9):827-832. DOI 10.1038/nbt.2647.

16. Hyun Y., Kim J., Cho S.W., ChoiY., Kim J.S., Coupland G. Site-directed mutagenesis in Arabidopsis thaliana using dividing tissue-targeted RGEN of the CRISPR/Cas system to generate heritable null alleles. Planta. 2015;241(1):271-284. DOI 10.1007/s00425-014-2180-5.

17. Jasin M., Haber J.E. The democratization of gene editing: Insights from site-specific cleavage and double-strand break repair. DNA Repair. 2016;44:6-16. DOI 10.1016/j.dnarep.2016.05.001.

18. Jiang W., Zhou H., Bi H., Fromm M., Yang B., Weeks D.P. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucl. Acids Res. 2013; 41(20):e188. DOI 10.1093/nar/gkt780.

19. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-821. DOI 10.1126/science.1225829.

20. Johnson R.A., Gurevich V., Filler S., Samach A., Levy A.A. Comparative assessments of CRISPR-Cas nucleases’ cleavage efficiency in planta. Plant Mol. Biol. 2015;87(1-2):143-156. DOI 10.1126/science. 1225829.

21. Karvelis T., Gasiunas G., Young J., Bigelyte G., Silanskas A., Cigan M., Siksnys V. Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif sequence elements. Genome Biol. 2015;16(1):1. DOI 10.1186/s13059-015-0818-7.

22. Labun K., Montague T.G., Gagnon J.A., Thyme S.B., Valen E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucl. Acids Res. 2016;44(W1):W272-6. DOI 10.1093/nar/gkw398.

23. Li J.F., Norville J.E., Aach J., McCormack M., Zhang D., Bush J., Church G.M., Sheen J. Multiplex and homologous recombinationmediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nature Biotechnol. 2013;31(8):688691. DOI 10.1038/nbt.2654.

24. Li Z., Liu Z.B., Xing A., Moon B.P., Koellhoffer J.P., Huang L., Ward R.T., Clifton E., Falco S.C., Cigan A.M. Cas9-guide RNA directed genome editing in soybean. Plant Physiol. 2015;169(2):960970. DOI 10.1104/pp.15.00783.

25. Lowder L.G., Zhang D., Baltes N.J., Paul III J.W., Tang X., Zheng X., Voytas D.F., Hsieh T.-F., Zhang Y., Qi Y. A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation. Plant Physiol. 2015;169(2):971-985. DOI 10.1104/pp.15.00636.

26. Luo M., Gilbert B., Ayliffe M. Applications of CRISPR/Cas9 technology for targeted mutagenesis, gene replacement and stacking of genes in higher plants. Plant Cell Reports. 2016;35:1-12. DOI 10.1007/s00299-016-1989-8.

27. Ma X., Zhang Q., Zhu Q., Liu W., Chen Y., Qiu R., Wang B., Yang Z., Li H., Lin Y., Xie Y., Shen R., Chen S., Wang Z., Chen Y., Guo J., Chen L., Zhao X., Dong Z., Liu Y.G. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Mol. Plant. 2015;8(8):1274-1284. DOI 10.1016/j.molp.2015.04.007.

28. Mali P., Aach J., Stranges P.B., Esvelt K.M., Moosburner M., Kosuri S., Yang L., Church G.M. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnol. 2013;31(9):833-838. DOI 0.1038/nbt.2675.

29. Mao Y., Zhang H., Xu N., Zhang B., Gou F., Zhu J.K. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Mol. Plant. 2013;6(6):2008-2011. DOI 10.1093/mp/sst121.

30. Mao Y., Zhang Z., Feng Z., Wei P., Zhang H., Botella J.R., Zhu J.K. Development of germ-line-specific CRISPR-Cas9 systems to improve the production of heritable gene modifications in Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 2016;14(2):519-532. DOI 10.1111/pbi.12468.

31. Miao J., Guo D., Zhang J., Huang Q., Qin G., Zhang X., Wan J., Gu H., Qu L.J. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Research. 2013;23(10):1233-1236. DOI 10.1038/cr.2013.123.

32. Mikami M., Toki S., Endo M. Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice. Plant Mol. Biol. 2015a;88(6):561-572. DOI 10.1007/s11103-015-0342-x.

33. Mikami M., Toki S., Endo M. Parameters affecting frequency of CRISPR/Cas9 mediated targeted mutagenesis in rice. Plant Cell Reports. 2015b;34(10):1807-1815. DOI 10.1007/s00299-015-1826-5.

34. Mikami M., Toki S., Endo M. Precision targeted mutagenesis via Cas9 paired nickases in rice. Plant Cell Physiol. 2016;57(5):1058-1068. DOI 10.1093/pcp/pcw049.

35. Nekrasov V., Staskawicz B., Weigel D., Jones J.D., Kamoun S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnol. 2013;31(8):691693. DOI 10.1038/nbt.2655.

36. Nishimasu H., Ran F.A., Hsu P.D., Konermann S., Shehata S.I., Dohmae N., Ishitani R., Zhang F., Nureki O. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 2014;156(5):935949. DOI 10.1016/j.cell.2014.02.001.

37. Osakabe Y., Watanabe T., Sugano S.S., Ueta R., Ishihara R., Shinozaki K., Osakabe K. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing to modify abiotic stress responses in plants. Sci. Reports. 2016;6: 26685. DOI 10.1038/srep26685.

38. Paul III J.W., Qi Y. CRISPR/Cas9 for plant genome editing: accomplishments, problems and prospects. Plant Cell Reports. 2016;1-11. DOI 10.1007/s00299-016-1985-z.

39. Periwal V. A comprehensive overview of computational resources to aid in precision genome editing with engineered nucleases. Brief. Bioinform. 2016;1-14. DOI 10.1093/bib/bbw052.

40. Puchta H., Dujon B., Hohn B. Homologous recombination in plant cells is enhanced by in vivo induction of double strand breaks into DNA by a site-specific endonuclease. Nucl. Acids Res. 1993;21(22):50345040. DOI 10.1093/nar/21.22.5034.

41. Puchta H., Fauser F. Synthetic nucleases for genome engineering in plants: prospects for a bright future. Plant J. 2014;78(5):727-741. DOI 10.1111/tpj.12338.

42. Qi Y., Zhang Y., Zhang F., Baller J.A., Cleland S.C., Ryu Y., Starker C.G., Voytas D.F. Increasing frequencies of site-specific mutagenesis and gene targeting in Arabidopsis by manipulating DNA repair pathways. Genome Res. 2013;23(3):547-554. DOI 10.1101/gr.145557.112.

43. Savitskaya E.E., Musharova O.S., Severinov K.V. Diversity of CRISPRCas-mediated mechanisms of adaptive immunity in prokaryotes and their application in biotechnology. Biomeditsinskaya Khimiya = Biomedical Chemistry (Moscow). 2016;81(7):653-661. DOI 10.1134/S0006297916070026. (in Russian)

44. Schaeffer S.M., Nakata P.A. The expanding footprint of CRISPR/Cas9 in the plant sciences. Plant Cell Reports. 2016;35(7):1451-1468. DOI 10.1007/s00299-016-1987-x.

45. Schiml S., Fauser F., Puchta H. The CRISPR/Cas system can be used as nuclease for in planta gene targeting and as paired nickases for directed mutagenesis in Arabidopsis resulting in heritable progeny. Plant J. 2014;80(6):1139-1150. DOI 10.1111/tpj.12704.

46. Shan Q., Wang Y., Li J., Zhang Y., Chen K., Liang Z., Zhang K., Liu J., Xi J.J., Qiu J.L., Gao C. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnol. 2013;31(8):686688. DOI 10.1038/nbt.2650.

47. Song G., Jia M., Chen K., Kong X., Khattak B., Xie C., Li A., Mao L. CRISPR/Cas9: A powerful tool for crop genome editing. Crop J. 2016;4(2):75-82. DOI 10.1016/j.cj.2015.12.002.

48. Steinert J., Schiml S., Fauser F., Puchta H. Highly efficient heritable plant genome engineering using Cas9 orthologues from Streptococcus thermophilus and Staphylococcus aureus. Plant J. 2015;84(6): 1295-1305. DOI 10.1111/tpj.13078.

49. Sun X., Hu Z., Chen R., Jiang Q., Song G., Zhang H., Xi Y. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci. Reports. 2015;5:10342. DOI 10.1038/srep10342.

50. Sun Y., Zhang X., Wu C., He Y., Ma Y., Hou H., Guo X., Du W., Zhao Y., Xia L. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase. Mol. Plant. 2016;9(4):628-631. DOI 10.1016/j.molp.2016.01.001.

51. Svitashev S., Young J.K., Schwartz C., Gao H., Falco S.C., Cigan A.M. Targeted mutagenesis, precise gene editing, and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA. Plant Physiol. 2015; 169(2):931-945. DOI 10.1104/pp.15.00793.

52. Wang Y., Cheng X., Shan Q., Zhang Y., Liu J., Gao C., Qiu J.L. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnol. 2014;32(9):947-951. DOI 10.1038/nbt.2969.

53. Wang Z.P., Xing H.L., Dong L., Zhang H.Y., Han C.Y., Wang X.C., Chen Q.J. Egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in Arabidopsis in a single generation. Genome Biol. 2015;16(1):144. DOI 10.1186/s13059-015-0715-0.

54. Xie K., Yang Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Mol. Plant. 2013;6(6):1975-1983. DOI 10.1093/mp/sst119.

55. Xie K., Zhang J., Yang Y. Genome-wide prediction of highly specific guide RNA spacers for CRISPR-Cas9-mediated genome editing in model plants and major crops. Mol. Plant. 2014;7(5):923-926. DOI 10.1093/mp/ssu009.

56. Xing H.L., Dong L., Wang Z.P., Zhang H.Y., Han C.Y., Liu B., Wang X.C., Chen Q.J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014;14(1):1. DOI 10.1186/s12870-014-0327-y.

57. Yan L., Wei S., Wu Y., Hu R., Li H., Yang W., Xie Q. High-efficiency genome editing in Arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Mol. Plant. 2015;8(12):1820-1823. DOI 10.1016/j.molp.2015.10.004.

58. Zaidi S.S.E.A., Mansoor S., Ali Z., Tashkandi M., Mahfouz M.M. Engineering plants for geminivirus resistance with CRISPR/Cas9 system. Trends Plant Sci. 2016;21(4):279-281. DOI 10.1016/j.tplants.2016.01.023.

59. Zhang H., Zhang J., Wei P., Zhang B., Gou F., Feng Z., Mao Y., Yang L., Zhang H., Xu N., Zhu J.K. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation. Plant Biotechnol. J. 2014;12(6):797-807. DOI 10.1111/pbi.12200.