Ген Non3 необходим для формирования ядрышка у Drosophila

Ядрышко представляет собой динамичную немембранную внутриядерную органеллу, которая играет ключевую роль как в биогенезе рибосом, так и в других клеточных процессах. Нарушение функции ядрышка ассоциировано со многими заболеваниями человека, в том числе с дегенеративными патологиями нервной и сердечно-сосудистой систем, а также с образованием злокачественных опухолей. В данной работе нами впервые охарактеризована функция гена Non3 (Novel nucleolar protein 3) у плодовой мушки Drosophila melanogaster, который кодирует гомолог Brix домен-содержащего белка человека Rpf2, участвующего в процессе созревания рибосомной РНК (рРНК). С помощью метода неточной эксцизии Р-элемента мы получили набор из четырех мутаций по гену Non3. Эти мутации формируют аллельный ряд, который включает в себя как жизнеспособные, так и летальные аллели. Non3∆600 – это нуль-аллель, который несет делецию большей части гена и является ранней рецессивной леталью. Мухи генотипа Non3∆600/+ демонстрируют очень слабое уменьшение длины и толщины торакальных щетинок, но при этом развиваются нормально и фертильны. Гетероаллельные комбинации жизнеспособных мутаций гена Non3 (Non3197, Non3310 и Non3259 ) имеют укороченные и тонкие торакальные щетинки, также у них наблюдается некоторое замедление онтогенеза. Такой же паттерн нарушений был ранее описан в литературе как Minute-like фенотип, который характерен при дефектах биогенеза рибосом. Кроме того, мы обнаружили, что белок Non3 является компонентом ядрышка в клетках вентрально-мозгового ганглия личинок третьего возраста и необходим для локализации белка Fibrillarin, важного для пост-трансляционной модификации и процессинга рРНК, в этом немембранном внутриядерном субкомпартменте. Полученный нами набор генетических и биохимических инструментов, использованных в ходе данной работы для первичной характеристики гена Non3, будет полезен также для исследований функции этого гена и его белкового продукта в будущем.

Drosophila melanogaster, ядрышко, фенотип Minute-like, Non3, Fibrillarin, Rpf2, Brix домен, биогенез рибосом

1. Biedka S., Micic J., Wilson D., Brown H., Diorio-Toth L., Wool- ford J.L., Jr. Hierarchical recruitment of ribosomal proteins and as-sembly factors remodels nucleolar pre-60S ribosomes. J. Cell Biol. 2018;217(7):2503-2518. https://doi.org/10.1083/jcb.201711037.

2. Bischof J., Maeda R.K., Hediger M., Karch F., Basler K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific фС31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007;104(9):3312-3317. https://doi.org/10.1073/pnas.06115nm4.

3. Bonaccorsi S., Giansanti M.G., Gatti M. Spindle assembly in Dro-sophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nat. Cell Biol. 2000; 2(1):54-56. https://doi.org/10.1038/71378.

4. Chalkley G.E., Verrijzer C.P. Immuno-depletion and purification strate¬gies to study chromatin-remodeling factors in vitro. Methods En- zymol. 2004;377:421-442. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(03)77028-1.

5. Cui Z., DiMario P.J. RNAi knockdown of Nopp140 induces Minute-like phenotypes in Drosophila. Mol. Biol. Cell. 2007;18(6):2179- 2191. https://doi.org/10.1091/mbc.e07-01-0074.

6. Draptchinskaia N., Gustavsson P., Andersson B., Pettersson M., Wil- lig T.N., Dianzani I., Ball S., Tchernia G., Klar J., Matsson H., Tentler D., Mohandas N., Carlsson B., Dahl N. The gene encoding ribosomal protein S19 is mutated in Diamond-Blackfan anaemia. Nat. Genet. 1999;21(2):169-175. https://doi.org/10.1038/5951.

7. Farley-Barnes K.I., McCann K.L., Ogawa L.M., Merkel J., Surov- tseva Y.V., Baserga S.J. Diverse regulators of human ribosome bio¬genesis discovered by changes in nucleolar number. Cell Rep. 2018; 22(7):1923-1934. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.01.056.

8. Fisher E.M.C., Beer-Romero P, Brown L.G., Ridley A., McNeil J.A., Lawrence J.B., Willard H.F., Bieber F.R., Page D.C. Homologous ribosomal protein genes on the human X and Y chromosomes: escape from X inactivation and possible implications for Turner syndrome. Cell. 1990;63(6):1205-1218.

9. Genuth N.R., Barna M. The discovery of ribosome heterogeneity and its implications for gene regulation and organismal life. Mol. Cell. 2018;71(3):364-374. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.07.018.

10. Goudarzi K.M., Lindstrom M.S. Role of ribosomal protein mutations in tumor development. Int. J. Oncol. 2016;48(4):1313-1324. https://doi.org/10.3892/ijo.2016.3387.

11. Gramates L.S., Marygold S.J., Santos G.D., Urbano J.M., Antonazzo G., Matthews B.B., Rey A.J., Tabone C.J., Crosby M.A., Emmert D.B., Falls K., Goodman J.L., Hu Y., Ponting L., Schroeder A.J., Stre¬lets V.B., Thurmond J., Zhou P., the FlyBase Consortium. FlyBase at 25: looking to the future. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D663- D671. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1016.

12. Gupta V, Warner J.R. Ribosome-omics of the human ribosome. RNA. 2014;20(7):1004-1013. https://doi.org/10.1261/rna.043653.113.

13. Henras A.K., Plisson-Chastang C., O’Donohue M.F., Chakraborty A., Gleizes P.E. An overview of pre-ribosomal RNA processing in eukaryotes. Wiley Interdiscip. Rev. RNA. 2015;6(2):225-242. https://doi.org/10.1002/wrna.1269.

14. Hoskins R.A., Carlson J.W., Wan K.H., Park S., Mendez I., Galle S.E., Booth B.W., Pfeiffer B.D., George R.A., Svirskas R., Krzywinski M., Schein J., Accardo M.C., Damia E., Messina G., Mendez-Lago M., de Pablos B., Demakova O.V., Andreyeva E.N., Boldyreva L.V., Marra M., Carvalho A.B., Dimitri P., Villasante A., Zhimulev I.F., Rubin G.M., Karpen G.H., Celniker S.E. The Release 6 reference sequence of the Drosophila melanogaster genome. Genome Res. 2015;25(3):445-458. https://doi.org/10.1101/gr.185579.114.

15. Huang W., Massouras A., Inoue Y., Peiffer J., Ramia M., Tarone A.M., Turlapati L., Zichner T., Zhu D., Lyman R.F., Magwire M.M., Blankenburg K., Carbone M.A., Chang K., Ellis L.L., Fernan¬dez S., Han Y., Highnam G., Hjelmen C.E., Jack J.R., Javaid M., Jayaseelan J., Kalra D., Lee S., Lewis L., Munidasa M., Ongeri F., Patel S., Perales L., Perez A., Pu L., Rollmann S.M., Ruth R., Saa- da N., Warner C., Williams A., Wu Y.Q., Yamamoto A., Zhang Y., Zhu Y., Anholt R.R., Korbel J.O., Mittelman D., Muzny D.M., Gibbs R.A., Barbadilla A., Johnston J.S., Stone E.A., Richards S., Deplancke B., Mackay T.F.C. Natural variation in genome architec¬ture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Res. 2014;24(7):1193-1208. https://doi.org/10.1101/gr.171546. 113.

16. Kearse M.G., Chen A.S., Ware V.C. Expression of ribosomal protein L22e family members in Drosophila melanogaster: rpL22-like is differentially expressed and alternatively spliced. Nucleic Acids Res. 2011;39(7):2701-2716. https://doi.org/10.1093/nar/gkq1218.

17. Kongsuwan K., Yu Q., Vincent A., Frisardi M.C., Rosbash M., Len- gyel J.A., Merriam J. A Drosophila Minute gene encodes a ribo-somal protein. Nature. 1985;317(6037):555-558.

18. Kressler D., Hurt E., Bafiler J. A puzzle of life: crafting ribosomal sub¬units. Trends Biochem. Sci. 2017;42(8):640-654. https://doi.org/10.1016/j. tibs.2017.05.005.

19. Lopes A.M., Miguel R.N., Sargent C.A., Ellis P.J., Amorim A., Af- fara N.A. The human RPS4 paralogue on Yq11.223 encodes a structurally conserved ribosomal protein and is preferentially ex-pressed during spermatogenesis. BMC Mol. Biol. 2010;11:33. https://doi.org/10.1186/1471-2199-11-33.

20. Mackay T.F., Richards S., Stone E.A., Barbadilla A., Ayroles J.F., Zhu D., Casillas S., Han Y., Magwire M.M., Cridland J.M., Richard¬son M.F., Anholt R.R., Barron M., Bess C., Blankenburg K.P., Carbone M.A., Castellano D., Chaboub L., Duncan L., Harris Z., Javaid M., Jayaseelan J.C., Jhangiani S.N., Jordan K.W., Lara F., Lawrence F., Lee S.L., Librado P, Linheiro R.S., Lyman R.F., Mac¬key A.J., Munidasa M., Muzny D.M., Nazareth L., Newsham I., Pe¬rales L., Pu L.L., Qu C., Ramia M., Reid J.G., Rollmann S.M., Ro¬zas J., Saada N., Turlapati L., Worley K.C., Wu Y.Q., Yamamoto A., Zhu Y., Bergman C.M., Thornton K.R., Mittelman D., Gibbs R.A. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 2012;482(7384):173-178. https://doi.org/10.1038/nature10811.

21. Markstein M., Pitsouli C., Villalta C., Celniker S.E., Perrimon N. Ex-ploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 2008;40(4):476- 483. https://doi.org/10.1038/ng.101.

22. Marygold S.J., Coelho C.M.A., Leevers S.J. Genetic analysis of RpL38 and RpL5, two Minute genes located in the centric hetero-chromatin of chromosome 2 of Drosophila melanogaster. Genetics. 2005;169(2):683-695. https://doi.org/10.1534/genetics.104.034124.

23. Marygold S.J., Roote J., Reuter G., Lambertsson A., Ashburner M., Millburn G.H., Harrison P.M., Yu Z., Kenmochi N., Kaufman T.C., Leevers S.J., Cook K.R. The ribosomal protein genes and Minute loci of Drosophila melanogaster. Genome Biol. 2007;8(10):R216. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-10-r216.

24. Mills E.W., Green R. Ribosomopathies: there’s strength in numbers. Science. 2017;358(6363):eaan2755. https://doi.org/10.1126/science.aan2755.

25. Morata G., Ripoll P. Minutes: mutants of Drosophila autonomously affecting cell division rate. Dev. Biol. 1975;42(2):211-221.

26. Moutinho-Pereira S., Stuurman N., Afonso O., Hornsveld M., Aguiar P., Goshima G., Vale R.D., Maiato H. Genes involved in centrosome- independent mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013;110(49):19808-19813. https://doi.org/10.1073/ pnas.1320013110.

27. Narla A., Ebert B.L. Ribosomopathies: human disorders of ribo¬some dysfunction. Blood. 2010;115(16):3196-3205. https://doi.org/10.1182/ blood-2009-10-178129.

28. Neumuller R.A., Gross T., Samsonova A.A., Vinayagam A., Buck¬ner M., Founk K., Hu Y., Sharifpoor S., Rosebrock A.P., Andrews B., Winston F., Perrimon N. Conserved regulators of nucleolar size re¬vealed by global phenotypic analyses. Sci. Signal. 2013;6(289):ra70. https://doi.org/10.1126/scisignal.2004145.

29. NMez Villacis L., Wong M.S., Ferguson L.L., Hein N., George A.J., Hannan K.M. New roles for the nucleolus in health and disease. BioEssays. 2018;40(5):e1700233. https://doi.org/10.1002/bies.201700233.

30. O’Brochta D.A., Gomez S.P., Handler A.M. P element excision in Dro¬sophila melanogaster and related drosophilids. Mol. Gen. Genet. 1991;225(3):387-394.

31. Ogienko A.A., Yarinich L.A., Fedorova E.V., Lebedev M.O., Andrey-eva E.N., Pindyurin A.V., Baricheva E.M. New slbo-Gal4 driver lines for the analysis of border cell migration during Drosophi¬la oogenesis. Chromosoma. 2018;127(4):475-487. https://doi.org/10.1007/ s00412-018-0676-7.

32. Olson M.O.J. Sensing cellular stress: another new function for the nucleolus? Sci. STKE. 2004;2004(224):pe10. https://doi.org/10.1126/stke. 2242004pe10.

33. Pederson T. The plurifunctional nucleolus. Nucleic Acids Res. 1998; 26(17):3871-3876.

34. Robertson H.M., Preston C.R., Phillis R.W., Johnson-Schlitz D.M., Benz W.K., Engels W.R. A stable genomic source ofP element trans- posase in Drosophilamelanogaster. Genetics. 1988;118(3):461-470.

35. Rodriguez-Corona U., Sobol M., Rodriguez-Zapata L.C., Hozak P., Castano E. Fibrillarin from Archaea to human. Biol. Cell. 2015; 107(6):159-174. https://doi.org/10.1111/boc.201400077.

36. Shi Z., Barna M. Translating the genome in time and space: spe-cialized ribosomes, RNA regulons, and RNA-binding proteins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2015;31:31-54. https://doi.org/10.1146/annurev- cellbio-100814-125346.

37. Somma M.P., Ceprani F., Bucciarelli E., Naim V., De Arcangelis V., Piergentili R., Palena A., Ciapponi L., Giansanti M.G., Pellacani C., Petrucci R., Cenci G., Verni F., Fasulo B., Goldberg M.L., Di Cun- to F., Gatti M. Identification of Drosophila mitotic genes by com-bining co-expression analysis and RNA interference. PLoS Genet. 2008;4(7):e1000126. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000126.

38. Somma M.P., Fasulo B., Cenci G., Cundari E., Gatti M. Molecular dissection of cytokinesis by RNA interference in Drosophila cultured cells. Mol. Biol. Cell. 2002;13(7):2448-2460. https://doi.org/10.1091/mbc.01- 12-0589.

39. Stage D.E., Eickbush T.H. Sequence variation within the rRNA gene loci of 12 Drosophila species. Genome Res. 2007;17(12):1888- 1897. https://doi.org/10.1101/gr.6376807.

40. Strunov A., Boldyreva L.V., Pavlova G.A., Pindyurin A.V., Gatti M., Kiseleva E. A simple and effective method for ultrastructural analy¬sis of mitosis in Drosophila S2 cells. MethodsX. 2016;3:551-559. https://doi.org/10.1016/j.mex.2016.10.003.

41. Tavares A.A.M., Glover D.M., Sunkel C.E. The conserved mitotic ki-nase polo is regulated by phosphorylation and has preferred microtubule-associated substrates in Drosophila embryo extracts. EMBO J. 1996;15(18):4873-4883.

42. Tutuncuoglu B., Jakovljevic J., Wu S., Gao N., Woolford J.L., Jr. The N-terminal extension of yeast ribosomal protein L8 is involved in two major remodeling events during late nuclear stages of 60S ri- bosomal subunit assembly. RNA. 2016;22(9):1386-1399. https://doi.org/10.1261/rna.055798.115.

43. van Nues R.W., Watkins N.J. Unusual C'/D' motifs enable box C/D snoRNPs to modify multiple sites in the same rRNA target region. Nucleic Acids Res. 2017;45(4):2016-2028.

44. Wehner K.A., Baserga S.J. The o70-like motif: a eukaryotic RNA binding domain unique to a superfamily of proteins required for ribosome biogenesis. Mol. Cell. 2002;9(2):329-339. https://doi.org/10.1016/ S1097-2765(02)00438-0.

45. Xue S., Barna M. Specialized ribosomes: a new frontier in gene regula¬tion and organismal biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012;13(6): 355-369. https://doi.org/10.1038/nrm3359.

46. Yang X., Mao F., Lv X., Zhang Z., Fu L., Lu Y., Wu W., Zhou Z., Zhang L., Zhao Y. Drosophila Vps36 regulates Smo trafficking in Hedgehog signaling. J. Cell Sci. 2013;126(Pt.18):4230-4238. https://doi.org/10.1242/jcs.128603.

47. Zhang J., Harnpicharnchai P., Jakovljevic J., Tang L., Guo Y., Oeffin- ger M., Rout M.P., Hiley S.L., Hughes T., Woolford J.L., Jr. Assembly factors Rpf2 and Rrs1 recruit 5S rRNA and ribosomal proteins rpL5 and rpL11 into nascent ribosomes. Genes Dev. 2007;21(20):2580- 2592. https://doi.org/10.1101/gad.1569307.