Ядро доимплантационных эмбрионов млекопитающих характеризуется своеобразной структурной организацией. На начальных стадиях дробления вместо функционально активных ядрышек в ядре эмбриона присутствуют так называемые проядрышки – фибриллярные электронно-плотные структуры, неактивные в отношении синтеза РНК. Подавляющее большинство проядрышек окружено кольцеообразной зоной транскрипционно неактивного гетерохроматина, который, однако, содержит не только эпигенетическую метку репрессированного хроматина – триметилированный гистон Н3K9me3, но и метку активного хроматина – ацетилированный гистон H4K5ac. По результатам непрямого иммуномечения, молекулярный состав кольцевого гетерохроматина в эмбрионах мыши изменяется в ходе реализации процессов активации эмбрионального генома, а также при искусственном подавлении транскрипционной активности. На стадии зиготы в составе кольцевого гетерохроматина выявляются некоторые факторы метаболизма мРНК, например SR-белок фактор сплайсинга SC35 (SRSF2) и базальный фактор транскрипции TFIID. На более поздних стадиях развития в этой области начинают выявляться другие ядерные белки, например Y14 – коровый компонент комплекса связи экзонов (EJC), а также белки, вовлеченные в ремоделинг хроматина – ATRX и Daxx. Типичным компонентом кольцевого гетерохроматина является актин, иммуноцитохимическое мечение которого наиболее выражено на двухклеточной стадии дробления, после активации эмбрионального генома. Характерно, что молекулярный состав гетерохроматина, ассоциированного с разными проядрышками в одном ядре, может различаться, что, возможно, отражает функциональную гетерогенность морфологически сходных проядрышек по их компетентности к процессу нуклеологенеза. В настоящем обзоре кратко обсуждаются некоторые особенности молекулярного состава гетерохроматина, ассоциированного с NPBs, и его возможные функции.

Рожь (Secale) входит в группу экономически важных злаков наряду с такими представителями трибы Triticeae, как пшеница и ячмень. Род Secale включает многолетние, однолетние, перекрестноопыля ющиеся и самоопыляющиеся виды, которые используются как источник ценных генов для улучшения существующих сортов пшеницы и ржи. Исследования структуры гена центромерного гистона H3 (CENH3), определяющего функциональную центромеру, сейчас становится актуальным для агрономически важных растений. Мы изучили нуклеотидное разнообразие последовательностей двух вариантов гена CENH3 ржи внутри N-терминального района (NTT) и консервативного домена (HFD) гена в роде Secale. Средние значения нуклеотидного разнообразия у диких перекрестно- и самоопыляющихся таксонов для доменов αCENH3 были близки для NTT (πtot = 0.0176–0.0090) и HFD (πtot = 0.0136–0.0052), а для βCENH3 средние значения были меньше в NTT (πtot = 0.0168–0.0062), чем в HFD (πtot = 0.0259–0.084). Значения нуклеотидного и гаплотипного разнообразия для доменов CENH3 были существенно меньше у таксонов, занимающих узкую географическую нишу, S. cereale subsp. dighoricum и S. strictum subsp. kuprijanovii. К снижению изменчивости нуклеотидных последовательностей доменов αCENH3 и βCENH3 приводит действие селекции: у сортов культивируемой ржи значения π варьируют от 0.0122 до 0. 0014. Значения нуклеотидного и гаплотипного разнообразия поддерживаются на одном уровне в последовательностях αCENH3 и βCENH3 у S. sylvestre, считающегося наиболее древним видом ржи. Полученные результаты подтверждают, что на частоту однонуклеотидных полиморфизмов и нуклеотидное разнообразие последовательностей вариантов CENH3 у видов Secale влияет ряд факторов, включая способы размножения, степень географической изоляции таксона, действие селекции, эволюционный возраст видов. 

Drosophila melanogaster – один из популярных модельных организмов для изучения репликации ДНК. Начиная с 1960-х годов репликацию политенных хромосом активно изучали c помощью цитологических методов. В последние двадцать лет прогресс в изучении репликации определялся применением новых методов. Использование флуоресцентных красителей значительно улучшило разрешение цитологических подходов. Наличие геномной последовательности позволило изучить и соотнести репликацию ДНК со структурой хроматина и активностью генов для эухроматиновых районов в масштабе генома. Картирование границ цитологических структур политенных хромосом на последовательности генома дало возможность сравнить временные характеристики репликации районов хромосом в клеточных культурах и клетках слюнной железы. Были описаны новые особенности репликации как для хромосом диплоидных клеток, так и для политенных хромосом дрозофилы. Анализ временных профилей репликации показал, что организация репликации имеет в своей основе те же закономерности, что и у других хорошо изученных с точки зрения репликации видов, в частности человека. Ранняя репликация, как правило, приурочена к районам, характеризующимся высоким уровнем транскрипции, высокой плотностью генов и присутствием множественных сайтов потенциальной инициации репликации. Компактность генома D. melanogaster вносит некоторые особенности в организацию ее репликации. Последовательность репликации генома в политенных хромосомах и хромосомах диплоидных клеток имеет много общего: инициация репликации приурочена к одним и тем же районам, между которыми лежат протяженные участки генома, где репликация происходит преимущественно от краев к середине. Важнейшими особенностями репликации в политенных хромосомах являются низкая скорость репликационных вилок и зависимость протяженности S-фазы от множества как внутренних, так и внешних факторов. В политенных хромосомах D. melanogaster скорость движения репликационных вилок зависит от присутствия в хроматине белков SUUR и Rif1.

Политенные хромосомы Drosophila melanogaster – удобная модель для изучения интерфазных хромосом эукариот. Им свойственны гигантские размеры в сравнении с хромосомами диплоидных клеток и поперечная исчерченность, возникающая в связи с упорядоченным расположением хроматид. Каждый район политенных хромосом обладает уникальным дисковым рисунком. С использованием модели четырех типов хроматина, которая выявляет домены различной степени компактизации, удалось соотнести физическую и цитологическую карты некоторых районов политенных хромосом и показать основные свойства генетической и молекулярной организации дисков и междисков, описанию которых посвящен данный обзор. Междискам на молекулярной карте генома соответствуют декомпактный aquamarine хроматин и 5’-концы повсеместно активных генов. Серые диски содержат промежуточный по уровню компактизации lazurite и malachite хроматин и в основном кодирующие части генов. Черные плотные транскрипционно неактивные диски обогащены ruby хроматином. Локализация нескольких десятков междисков на молекулярной карте генома позволила по данным полногеномных проектов подробно исследовать их архитектуру. Распределение белков и регуляторных элементов генома в промоторных районах генов, локализованных в междисках, показывает, что эти части междисков, вероятно, отвечают за формирование хроматина открытого типа, который визуализируется в политенных хромосомах как междиски. Таким образом, постоянная генетическая активность междисков и серых дисков и неактивность генов в черных дисках лежат в основе универсального дискового рисунка в хромосомах всех тканей дрозофилы. Особый случай представляет самая маленькая – четвертая – хромосома дрозофилы с нетипичной белковой композицией хроматина. При помощи модели четырех состояний хроматина и флуоресцентной in situ гибридизации была уточнена ее цитологическая карта и определены геномные координаты всех дисков и междисков. Показано, что, несмотря на особенности этой хромосомы, ее дисковая организация в целом соответствует остальному геному. Выбиваются из общей схемы особо длинные гены разных хромосом дрозофилы, которые могут занимать целую серию чередующихся дисков и междисков (до девяти структур), образованных частями этих генов.

Формирование интерфазной хромосомы представляет собой многоуровневый процесс, в результате которого ДНК упаковывается в тысячи раз. На первом этапе упаковки образуются нуклеосомы – базовые повторяющиеся единицы хроматина. Дальнейшая упаковка происходит за счет связывания ДНК с гистоном Н1 и негистоновыми белками, участвующими в ближних и дальних энхансер-промоторных и инсуляторных взаимодействиях. При этом функциональность генома сохраняется за счет динамичной и неравномерной упаковки ДНК вдоль хромосомы, что проявляется уже на нуклеосомном уровне. Несмотря на долгую историю изучения процесса упаковки ДНК в интерфазном ядре, до сих пор до конца не ясно, от чего зависит степень упаковки разных участков ДНК и какое влияние оказывают друг на друга разные уровни упаковки. Превосходной модельной системой для изучения молекулярных механизмов, определяющих степень упаковки ДНК, являются политенные хромосомы слюнных желез личинок дрозофилы. За счет больших размеров и характерного диск/междискового рисунка они позволяют легко наблюдать неравномерность упаковки ДНК вдоль хромосом. В настоящей работе мы исследовали, какую роль играют негистоновые регуляторные белки ADF1 и BEAF-32 в позиционировании нуклеосом и формировании междиска 61С7/С8 – одного из декомпактных районов политенных хромосом. ADF1 – специфический транскрипционный фактор, а BEAF-32 – инсуляторный белок, ассоциированный с междисками. С использованием трансгенных линий мы показали, что мутации сайтов связывания ADF1 или BEAF-32 приводят к тому, что трансген теряет способность формировать междиск в новом генетическом окружении. Кроме того, мутации нарушают нуклеосомную организацию трансгена, характеризующуюся повышением стабильности нуклеосом. Мы обнаружили, что сайты связывания ADF1 и BEAF-32 необходимы для спасения нуль-аллеля bantam – жизненно важного гена микроРНК, расположенного в районе 61С7/С8. Таким образом, мы можем проследить связь между степенью упаковки ДНК, нуклеосомной организацией и функцией конкретного участка интерфазной хромосомы.

Сборка хроматина – фундаментальный процесс, необходимый для дупликации хромосом в процессе репликации ДНК. Кроме того, удаление гистонов и их инкорпорирование постоянно происходят в течение клеточного цикла в ходе процессов метаболизма ДНК, таких как транскрипция, восстановление повреждений или рекомбинация. Исследования in vitro показали, что сборка хроматина требует совместного действия гистоновых шаперонов и использующих энергию АТФ хроматин-ремоделирующих факторов – ACF или CHD1. Несмотря то, что АТФ-зависимые факторы сборки и ремоделирования хроматина хорошо охарактеризованы биохимически, оставалось неясным, до какой степени сборка нуклеосом является АТФ-зависимым процессом in vivo. Наши собственные и опубликованные в литературе данные о функциях АТФ-зависимых хроматин-ремоделирующих факторов показывают, что эти белки существенны для сборки нуклеосом и обмена гистонов и in vivo. CHD1 – критически важный фактор при реорганизации мужского пронуклеуса после оплодотворения, в процессе которой происходит независимая от репликации сборка хроматина, содержащего вариантный гистон Н3.3. Следовательно, молекулярные моторные белки, такие как CHD1, функционируют in vivo не только в ремоделировании существующих нуклеосом, но также и в сборке нуклеосом de novo из ДНК и гистонов. АТФ-зависимые факторы сборки и ремоделирования хроматина участвуют в процессе обмена гистонов во время транскрипции и репарации ДНК, в поддержании центромерного хроматина и образовании и ремоделировании нуклеосом позади прохождения репликационной вилки. Таким образом, хроматин-ремоделирующие факторы участвуют в процессах как зависимой, так и не зависимой от репликации сборки хроматина. Их роль особенно заметна в процессах крупномасштабной реорганизации хроматина, например при реорганизации хроматина мужского пронуклеуса или при восстановлении повреждений ДНК. Гипероновые шапероны, модифицирующие хроматин ферменты и АТФ-зависимые факторы сборки хроматина совместно образуют сеть факторов, обеспечивающих поддержание целостности хроматина.

Белок Su(Hw) был впервые идентифицирован как ДНК-связывающий компонент инсуляторного комплекса. Инсуляторы представляют собой регуляторные элементы, которые могут блокировать энхансер-промоторные взаимодействия и работать как границы между активным и репрессивным хроматином. Su(Hw)-зави симый белковый комплекс – уникальная модель для изучения инсуляторов, поскольку основные структурные компоненты, влияющие на его активность, уже известны. Однако механизмы, вовлекающие этот комплекс в различные регуляторные процессы, и детали взаимодействий между компонентами Su(Hw) инсуляторов остаются недостаточно изученными. Наши недавние работы выявили детальный механизм формирования и функционирования инсулятора Su(Hw). В представленном обзоре мы демонстрируем, как множественные взаимодействия между основными компонентами Su(Hw)-зависимого комплекса (Su(Hw)/ Mod(mdg4)-67.2/CP190) влияют на его активность. Показываем, что Su(Hw) может регулировать энхансерпромоторные взаимодействия через новый механизм нейтрализации инсулятора и, корме того, участвует в прямой регуляции активности близлежащих промоторов. Наконец, мы описываем механизм формирования «инсуляторных телец» и предлагаем модель, объясняющую их роль в рекрутировании Su(Hw)-зависимого комплекса на хроматин.

Гистон-ацетил трансферазный комплекс SAGA/TFTC играет важную роль в регуляции транскрипции. Нами было обнаружено, что TFTC/STAGA комплексы метазоа деубиквитинируют гистоны H2Aи H2B. Был определен модуль TFTC/STAGA комплекса, который обладает деубиквитиназной активностью (DUBm). Мы исследовали DUBm у Drosophila melanogaster и идентифицировали гомологи – компоненты DUBm дрожжей. Нами было показано, что белок Sgf11, один из компонентов DUBm у Drosophila, обладает другой, отличной от DUBm функцией. Белок Sgf11 ассоциирован с CAP-содержащим комплексом и рекрутируется на растущую матричную рибонуклеиновую кислоту (мРНК). Кроме того, мы обнаружили, что Sgf11 взаимодействует с TREX-2/AMEX комплексом экспорта мРНК, и этот белок необходим для экспорта мРНК из ядра. Другие две субъединицы DUBm Drosophila также обладают функциями, отличными от функции DUBm. Так, выявлено, что Sus1/ENY2 присутствует в нескольких различных комплексах. Эксперименты по иммуноокрашиванию политенных хромосом личинок Drosophila показали, что Sgf11 присутствует на всех сайтах локализации генов, кодирующих мяРНК, и что так же, как hSNAPC1, dPbp45, субъединица PBP комплекса, играющая ключевую роль в транскрипции мяРНК, присутствует не только в сайтах генов мяРНК, но и в других сайтах активной транскрипции, осуществляемой РНКполимеразой II (PolII). Мы провели колокализацию на политенных хромосомах белков Sgf11 и Brf1 (компонента комплекса РНК-полимеразы III) и обнаружили, что Sgf11 находится во многих сайтах активной транскрипции и присутствует в тех же сайтах, что Brf1. Таким образом, мы показали, что SAGA коактивирует транскрипцию как РНК-полимеразы II-зависимых, так и РНК-полимеразы III-зависимых генов малых ядерных РНК.

Белки, имеющие в своем соcтаве BTB-домены, играют важную роль в процессах активации и репрессии транскрипции. Белки, содержащие BTB-домены, широко распространены только среди высших эукариот. Многие из таких белков являются транскрипционными факторами, принимающими участие в процессах развития организма. Один из ключевых регуляторов процессов раннего развития – BTB-содержащий белок Ttk (tramtrack), способный взаимодействовать с комплексом ремоделирования нуклеосом и деацетилирования гистонов (dNuRD) дрозофилы. Белок Ttk69 способен напрямую взаимодействовать с двумя белками комплекса dNuRD complex, dMi-2 и MEP1. Можно предположить, что Ttk69 репрессирует мишеневые гены путем ремоделирования хроматина через привлечение комплекса dNuRD. Однако до сих пор неизвестно, что обеспечивает специфичность рекрутирования Ttk на хроматин в процессе негативной/позитивной регуляции генной экспрессии. Несмотря на то что Ttk69 обладает ДНК-связывающей активностью, протяженных специфичных мотивов связывания для него найдено не было. Целью данного исследования был поиск белков, которые могут участвовать в привлечении Ttk к геномным регуляторным элементам. Для поиска белков-партнеров Ttk был проведен скрининг в дрожжевой двугибридной системе против коллекции белков с кластерами доменов «цинковые пальцы» C2H2-типа, способных эффективно и специфично связываться с сайтами в хроматине. В результате два белка, CG10321 и CG1792, были описаны в качестве потенциальных ДНК-связывающих партнеров Ttk. Мы предполагаем, что CG10321 и CG1792 обеспечивают специфичность посадки Ttk на сайты и, как следствие, привлечение NuRD-комплекса к геномным регуляторным элементам. Мы обнаружили также, что белок Ttk может одновременно взаимодействовать с MEP1 и ZnF-белками.

Комплексы, ремоделирующие хроматин, играют важную роль в экспрессии генов при эмбриональном развитии и во взрослом организме. Мутации субъединиц этого комплекса часто летальны или приводят к дефектам развития. Один из основных комплексов эукариот, изменяющих структуру хроматина, – комплекс PBAF, входящий в семейство SWI/SNF комплексов. Комплекс PBAF состоит из коровых субъединиц (Brg1, BAF155/BAF170, BAF47 и др.) и субъединиц специфического модуля (PHF10, BAF200, BAF180 и BRD7). Коровые субъединицы – это структурные субъединицы и АТФаза, специфические субъединицы – субъединицы, необходимые для связывания хроматина. Субъединичный состав комплекса не является постоянным. В процессе развития и дифференцировки клеток организма субъединицы комплекса заменяются гомологичными, что обуславливает специфичность работы комплекса на различных генах. Белок PHF10 – субъединица модуля PBAF комплекса, он играет важную роль в регуляции генов млекопитающих. В клетках и тканях человека и мыши PHF10 представлен четырьмя изоформами. Изоформы PHF10 имеют разную доменную структуру N- и C-концов, что определяет их свойства – различную клеточную локализацию, стабильность и модификационные паттерны. Две изоформы PHF10 (PHF10-P) экспрессируются на высоком уровне в нейрональных и миелоидных предшественниках и необходимы для пролиферации клеток. Эти изоформы содержат домены типа «PHD-пальцев», необходимые для связывания нуклеосом, и рекрутируют РНК-полимеразу II на промоторы генов клеточного цикла. Две другие изоформы (PHF10-S) вместо PHD доменов на C-конце имеют мотив PDSM для конъюгации SUMO1. Белок PHF10 представляет собой наиболее нестабильную субъединицу комплекса PBAF. Стабильность изоформ может регулировать скорость замены субъединиц в PBAF комплексе. Все PHF10 изоформы деградируют посредством убиквитинирования, осуществляемого B-TrCP убиквитин-лигазой, и дальнейшего расщепления 26-S протеасомой. Изоформы PHF10 содержат кластер серинов (X-кластер), подвергающийся интенсивному фосфорилированию казеин-киназой. Это фосфорилирование защищает B-TrCP дегрон от узнавания B-TrCP убиквитин-лигазой и последующей деградации, что приводит к большей стабильности PHF10-S форм по сравнению с PHF10-P формами. Таким образом, включение в PBAF изоформ PHF, обладающих различными паттернами фосфорилирования и различной стабильностью, влияет на функции целого PBAF комплекса и определяет спектр ремоделируемых генов.

Ядрышко представляет собой динамичную немембранную внутриядерную органеллу, которая играет ключевую роль как в биогенезе рибосом, так и в других клеточных процессах. Нарушение функции ядрышка ассоциировано со многими заболеваниями человека, в том числе с дегенеративными патологиями нервной и сердечно-сосудистой систем, а также с образованием злокачественных опухолей. В данной работе нами впервые охарактеризована функция гена Non3 (Novel nucleolar protein 3) у плодовой мушки Drosophila melanogaster, который кодирует гомолог Brix домен-содержащего белка человека Rpf2, участвующего в процессе созревания рибосомной РНК (рРНК). С помощью метода неточной эксцизии Р-элемента мы получили набор из четырех мутаций по гену Non3. Эти мутации формируют аллельный ряд, который включает в себя как жизнеспособные, так и летальные аллели. Non3∆600 – это нуль-аллель, который несет делецию большей части гена и является ранней рецессивной леталью. Мухи генотипа Non3∆600/+ демонстрируют очень слабое уменьшение длины и толщины торакальных щетинок, но при этом развиваются нормально и фертильны. Гетероаллельные комбинации жизнеспособных мутаций гена Non3 (Non3197, Non3310 и Non3259 ) имеют укороченные и тонкие торакальные щетинки, также у них наблюдается некоторое замедление онтогенеза. Такой же паттерн нарушений был ранее описан в литературе как Minute-like фенотип, который характерен при дефектах биогенеза рибосом. Кроме того, мы обнаружили, что белок Non3 является компонентом ядрышка в клетках вентрально-мозгового ганглия личинок третьего возраста и необходим для локализации белка Fibrillarin, важного для пост-трансляционной модификации и процессинга рРНК, в этом немембранном внутриядерном субкомпартменте. Полученный нами набор генетических и биохимических инструментов, использованных в ходе данной работы для первичной характеристики гена Non3, будет полезен также для исследований функции этого гена и его белкового продукта в будущем.

Ген Notch играет ключевую роль в развитии органов и тканей нейроэктодермального происхождения, в том числе нервной системы. У эукариотических организмов сигнальный каскад Notch вовлечен в процессы клеточной детерминации. Впервые ген Notch был открыт у Drosophila melanogaster. У млекопитающих семейство Notch рецепторов включает четыре гомолога. У человека мутации в гене Notch приводят к развитию ряда наследственных заболеваний, а также связаны с канцерогенезом. Исследования регуляторной зоны гена Notch на D. melanogaster насчитывают уже несколько десятилетий. В статье сделан обзор результатов и методов этих исследований. Регуляторная зона гена находится в районе открытого состояния хроматина, соответствующем междиску 3C6/3C7 на цитологической карте политенных хромосом слюнных желез D. melanogaster. Развитие новых методов направленного геномного редактирования позволило создать систему для введения направленных изменений в регуляторную зону гена. Используя систему CRISPR/Cas9, мы получили делецию в регуляторной и промоторной зоне гена Notch, включая его первый экзон, и ввели сайт attP в первый интрон гена Notch. Это сделало возможным направленное изменение последовательностей регуляторной и промоторной зон гена.

Открытие явления мозаичного эффекта положения гена и последующий тщательный анализ его молекулярных механизмов привели к пониманию того, что локальный состав хроматина оказывает существенное влияние на активность генов. Разработанный недавно метод Thousands of Reporters Integrated in Parallel (TRIP) основан на использовании штрихкодированных генов-репортеров и позволяет выполнять высокопроизводительный анализ эффекта положения гена в масштабе всего генома. В настоящей работе мы описываем конструирование и проверку качества штрихкодированных плазмидных библиотек высокой сложности, которые предполагается использовать для высокопроизводительного анализа эффекта положения гена в клетках дрозофилы. Во-первых, рассмотрены наиболее важные параметры, которые следует учитывать при создании штрихкодированных плазмидных библиотек, и предложен простой метод оценки сложности вырожденного фрагмента (штрихкода) в синтетических олигонуклеотидах с использованием ПЦР-амплификации и последующего секвенирования по методу Сэнгера. Далее проведено сравнение традиционного метода клонирования посредством рестрикции – лигирования с подходом сборки по методу Гибсона для клонирования штрихкодов в один и тот же плазмидный вектор. Кроме того, описаны оптимизированные параметры для создания штрихкодированных плазмидных библиотек, такие как соотношение вектор : вставка в реакции сборки методом Гибсона и напряжение, используемое для электропорации бактериальных клеток продуктами лигирования. Сравниваются также различные подходы для проверки качества штрихкодированных плазмидных библиотек. Наконец, кратко описаны альтернативные подходы, которые можно использовать для создания таких библиотек. Важно отметить, что все улучшения и модификации методов, приведенные в данной работе, могут быть применены к широкому кругу экспериментов, в которых используются штрихкодированные плазмидные библиотеки.

Механизмы экспрессии экдизон-зависимых генов исследуются на протяжении нескольких десятилетий. Исходно активация транскрипции отдельных генов под воздействием экдизона была исследована на модели политенных хромосом Drosophila melanogaster. Эти работы помогли изучить многочисленные аспекты развития дрозофилы и выявили ценную информацию относительно фундаментальных механизмов, управляющих работой генов. Модель, описывающая процесс активации генов экдизоном, была предложена еще много лет назад и названа по имени ее автора – Ashburner model. Данная модель до сих пор считается прекрасным описанием экдизонового каскада, который реализуется в слюнных железах во время формирования куколки дрозофилы. Однако к настоящему времени сформировалось понимание того, что ответ клеток на экдизон может развиваться разным образом в зависимости от типа клеток. Под воздействием экдизона одни и те же гены могут активироваться или репрессироваться в клетках различного происхождения. Судя по всему, за такую тканеспецифичность отвечают определенные ДНК-связывающие транскрипционные факторы, которые вовлечены в экдизон-зависимый ответ вместе с EcR/Usp гетеродимером. На сегодняшний день описано множество транскрипционных регуляторов, вовлеченных в процесс экдизонового ответа. Среди них несколько комплексов, ответственных за ремоделирование и модификацию хроматина. Различными методами было показано, что экдизон-зависимая активация/репрессия транскрипции генов протекает со значительными структурными изменениями хроматина на регуляторных элементах. Описание молекулярного механизма этого процесса, в частности роли в нем отдельных белков, а также структурных взаимодействий между различными регуляторными элементами, – дело будущего. Целью нашего обзора является обсуждение имеющейся информации относительно регуляторов транскрипции, взаимодействующих с экдизоновым рецептором. Приведено краткое описание механизма участия регулятора в экдизоновом ответе, а также ссылки на соответствующее исследование. Обсуждаются общие аспекты механизма экдизон-зависимой регуляции транскрипции в свете последних исследований и выделены наиболее перспективные моменты, которые кажутся нам интересными для дальнейшего изучения.

Несмотря на быстрое развитие подходов, контролирующих транскрипцию экзогенных генов во времени и пространстве, разработка систем, обеспечивающих точную регуляцию экспрессии эндогенных генов, является намного более сложной. Однако для дальнейшего прогресса в области безопасной и эффективной генной терапии, а также регенеративной медицины совершенно необходимо искать подходы для контроля активности эндогенных генов. Кроме того, такие подходы представляют интерес для исследований в области генетики, молекулярной и клеточной биологии. Идеальная система для регуляции транскрипции интересующего гена должна удовлетворять следующим требованиям: быть настраиваемой, обратимой, тканеспецифичной и регулируемой во времени. Несмотря на то что в настоящее время известны системы для регуляции транскрипции эндогенных генов, индуцируемые химическими агентами, наиболее многообещающими для применения в области генной терапии представляются оптогенетические системы, поскольку они неинвазивные и нетоксичные. Также оптогенетические системы не зависят от скорости диффузии химического агента и фармакокинетики и обнаруживают высокую скорость переключения между активным и неактивным состояниями. Причем системы, контролируемые светом длинноволнового диапазона, являются наиболее предпочтительными для использования в тканях млекопитающих по сравнению с системами, использующими свет с короткой длиной волны. Это связано с тем, что дальний красный и ближний инфракрасный свет обладают наибольшей проницаемостью в ткани млекопитающих, благодаря меньшему рассеиванию света, вызванному липидами, и сниженной автофлуоресценции тканей на длинах волн более 700 нм. В данном обзоре мы рассматриваем свето-индуцируемые системы, основанные на использовании синтетических факторов, которые способны связываться с любой желаемой последовательностью ДНК, обеспечивая тем самым направленную активацию или репрессию интересующих эндогенных генов. Такие синтетические факторы основаны на белках типа цинковый палец, TALE-ассоциированных белках (transcription activator-like effectors) и технологии CRISPR/Cas9. Мы обсуждаем также преимущества и недостатки этих ДНК-связывающих факторов для оптогенетической регуляции активности генов.

Черный коршун Milvus migrans – распространенный пернатый хищник, который обладает исключительной экологической пластичностью, населяет самые разные биотопы и постепенно становится все более синантропным видом. Ареал обитания черного коршуна охватывает Евразию, Африку, Австралию и прилежащие острова. Коршуны Палеарктики мигрируют на зиму в Африку, Индию и Китай, а коршуны, населяющие Африку и Австралию, частью являются оседлыми, а частью – сезонными мигрантами. Огромный ареал и высокая мобильность обусловливают сложную популяционную структуру черного коршуна. Традиционно выделяется от пяти до семи подвидов, каждый из которых населяет достаточно обширную территорию и имеет более или менее выраженные фенотипические отличия. В последние годы начала накапливаться информация о генетических различиях между популяциями черного коршуна, и эти данные не всегда подтверждают традиционные представления о филогении подвидов. В данной статье мы рассмотрим, какая информация о генетических характеристиках подвидов черного коршуна доступна на сегодняшний день.

Природная гибридизация значительно увеличивает фенотипическую и генотипическую изменчивость и формирует внутривидовую структуру, изучением которой занимается филогеография. Нами исследована изменчивость митохондриального и полного геномов птиц семейства врановые Corvidae, родов Corvus, Pica, Cyanopica, Perisoreus и Nucifraga. Анализируя классический случай естественной гибридизации между серой и черной воронами (Corvus corone cornix и C. c. corone) в Сибири, мы не обнаружили предполагаемого уменьшения приспособленности гибридов, однако установили ассортативность скрещиваний, которая должна ограничивать ширину гибридной зоны. В результате использования нескольких подходов и генетических маркеров не найдено различий между серой и черной воронами, но в процессе секвенирования митохондриального генома установлено наличие дифференциации на два гаплотипа в пределах ареала восточной черной вороны. При полногеномном секвенировании нами впервые обнаружена явная диверсификация чистых форм и гибридов по SNP и исследованы участки генома с повышенной дифференциацией – «островки видообразования». Сопоставление геномов птиц из европейской и сибирской гибридных зон выявило частично разные участки, ответственные за меланогенез, с признаками дивергентного отбора. Сравнительная филогеография десяти видов врановых, широко распространенных в Палеарктике, позволила выделить две категории ареалов: с дифференциацией на западные и восточные группы гаплотипов и без такого разделения. Это можно объяснить различными экологическими предпочтениями: к полуоткрытым биотопам у птиц первой группы и к лесам у второй. Представители второй группы пережили плейстоценовые оледенения в предполагаемом единственном лесном рефугиуме с последующим бутылочным горлышком, что объясняет их гомогенность, а виды первой группы могли сформироваться в нескольких местах. Один из таких видов – сорока Pica pica – имеет разрыв ареала в Забайкалье, который в настоящее время заполняется. Принадлежащие разным гаплогруппам популяции, различающиеся по фенотипам, мтДНК и вокализации, образуют зону контакта с ограниченной гибридизацией, но в целом репродуктивно изолированы. Таким образом, современная динамика видовых ареалов формирует филогеографическую структуру видов.

Хромосомные перестройки могут приводить к формированию новых устойчивых кариотипов, изменяя при этом архитектонику ядра. Различия в локализации хромосом, вероятно, обусловливают неслучайность робертсоновских (Rb) транслокаций и влияют на мейотический драйв как в пользу измененных хромосом, так и против них. Мы предположили, что благодаря гибридизации и мейотическому драйву могут возникать новые хромосомные формы у слепушонок Ellobius tancrei. Был поставлен эксперимент по гибридизации двух форм с одинаковым 2n = 50, но с разными робертсоновскими метацентриками. За десять лет инбредных скрещиваний (сестра – брат) получено девять поколений гибридов (262 помета, 578 животных). У гибридов первого поколения сохранялось диплоидное число 2n = 50, но в силу неполной (монобрахиальной) гомологии в профазе мейоза I помимо 20 бивалентов были выявлены два тривалента и один тетравалент. Гибриды первого поколения имели более низкую плодовитость по сравнению с родительскими формами. Начиная с третьего поколения плодовитость повышалась. Вместо возвращения к родительским кариотипам гибриды второго и последующих поколений получили новые наборы хромосом, отличающиеся диплоидным числом (48, 49, 51, 52) и комбинациями робертсоновских метацентриков. Анализ мейоза у гибридов F4, F7 и F9 показал, что гомологичный синапсис хромосом может быть затруднен из-за наличия гетерозигот и монобрахиальной гомологии, однако некоторые клетки успешно проходят мейоз, что приводит к формированию жизнеспособных гамет и рождению гибридов. Проведенный нами эксперимент воспроизводит процессы, происходящие в естественных условиях, и дает основания считать мейотический драйв основным механизмом, обеспечивающим диверсификацию и быструю фиксацию возникающих хромосомных форм в природе.

Привычное невынашивание беременности является тяжелой репродуктивной патологией, при этом почти в половине случаев его этиология остается невыясненной. В настоящей работе проведено исследование протяженных гомозиготных районов (runs of homozygosity – ROH) в геноме как возможного этиологического фактора в развитии привычного невынашивания беременности. Всего проанализировано 22 парных абортуса первого триместра беременности от 11 женщин с привычным невынашиванием беременности. У всех абортусов был нормальный кариотип по результатам метафазного кариотипирования и сравнительной геномной гибридизации на метафазных пластинках. Для поиска гомозиготных регионов были использованы микрочипы SurePrint G3 Human CGH + SNP 4 × 180K (Agilent Technologies). В результате в экстраэмбриональных тканях 15 абортусов выявлены 39 гомозиготных областей. Для образцов с повторяющимися ROH была проведена верификация с помощью секвенирования по Сэнгеру. Для 25 протяженных ROH было показано наличие единичных гетерозиготных SNP, что может свидетельствовать в пользу того, что они образуются не de novo, а наследуются от родителей. При этом в ходе наследования в ряду поколений в них могут накапливаться мутации, приводящие к гетерозиготизации изначально гомозиготных участков генома. Один из возможных механизмов влияния таких унаследованных ROH на патогенез привычного невынашивания беременности – гомозиготизация рецессивных мутаций. Высокая частота длинных ROH, обнаруженная в настоящем исследовании, указывает на роль инбридинга в этиологии привычного невынашивания беременности. Гомозиготные области могут возникать также из-за однородительской дисомии, следовательно, аномалии геномного импринтинга могут быть другим механизмом, ответственным за патологическое проявление гомозиготных районов в эмбриогенезе. В составе обнаруженных регионов гомозиготности в соответствии с базой данных Geneimprint было выявлено пять предположительно импринтированных генов: OBSCN, HIST3H2BB, LMX1B, CELF4 и FAM59A. В результате проведенного исследования впервые показана высокая частота длинных ROH в тканях спонтанных абортусов с нормальным кариотипом из семей с привычным невынашиванием беременности.