Сравнительный анализ первичной структуры и получение рекомбинантной поли(ADP-рибоза)полимеразы 1 долгоживущего Heterocephalus glaber

Репарация ДНК – важнейший клеточный процесс, который способствует поддержанию целостности генома. В настоящее время эффективная работа систем репарации ДНК рассматривается исследователями как один из ключевых факторов, определяющих максимальную продолжительность жизни. Центральным регулятором процесса репарации ДНК является фермент поли(ADP-рибоза)полимераза 1 (PARP1), способный синтезировать полимер поли(ADP-рибозы) (PAR) в ответ на повреждение ДНК и присоединять его к белкаммишеням, в число которых входит и сам PARP1, осуществляя тем самым посттрансляционную модификацию этих белков и регулируя их сродство к ДНК. PARP1 принимает участие и во многих других процессах, ассоциированных с клеточным старением, таких как поддержание целостности теломер и развитие воспалительной реакции. Свойства PARP1 как изолированного белка практически не исследовались у млекопитающих, которые демонстрируют высокую максимальную продолжительность жизни, за исключением человека. Одним из перспективных объектов таких исследований считается голый землекоп (Heterocephalus glaber), имеющий экстремально высокую максимальную продолжительность жизни, а также более эффективно функционирующие системы репарации ДНК, которые обеспечивают высокую устойчивость его клеток к воздействию ряда генотоксических агентов, по сравнению с другими мелкими грызунами, например, близкой по размеру и массе тела мышью (Mus musculus). В настоящей работе проведено сравнение аминокислотной последовательности PARP1 голого землекопа с аминокислотными последовательностями белков-ортологов других млекопитающих. В отличие от PARP1 человека, в аминокислотной последовательности PARP1 голого землекопа выявлено 13 эволюционно консервативных аминокислотных замен в различных функциональных доменах белка. С использованием поиска в базах данных последовательности кДНК гена Parp1 голого землекопа и последующего анализа путем выравнивания транскриптомных данных выбрана соответствующая экспрессируемому варианту Parp1 последовательность кДНК, которая была клонирована с помощью экспрессионного вектора на основе плазмиды pLate31. В результате экспрессии в штамме Escherichia coli BL21(DE3)GeneX и очистки, проведенной с использованием трех хроматографических стадий, впервые был получен и охарактеризован функционально активный фермент PARP1 голого землекопа.

1. Alemasova E.E., Lavrik O.I. Poly(ADP-ribose) in condensates: the partnership of phase separation and site-specific interactions. Int. J. Mol. Sci. 2022;23(22):14075. https://doi.org/10.3390/ijms232214075

2. Beneke S., Alvarez-Gonzalez R., Bürkle A. Comparative characterisation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 from two mammalian species with different life span. Exp. Gerontol. 2000;35(8):989-1002. https://doi.org/10.1016/s0531-5565(00)00134-0

3. Beneke S., Scherr A.L., Ponath V., Popp O., Bürkle A. Enzyme characteristics of recombinant poly(ADP-ribose) polymerases-1 of rat and human origin mirror the correlation between cellular poly(ADPribosyl)ation capacity and species-specific life span. Mech. Ageing Dev. 2010;131(5):366-369. https://doi.org/10.1016/j.mad.2010.04.003

4. Bens M., Sahm A., Groth M., Jahn N., Morhart M., Holtze S., Hildebrandt T.B., Platzer M., Szafranski K. FRAMA: from RNA-seq data to annotated mRNA assemblies. BMC Genomics. 2016;17:54. https://doi.org/10.1186/s12864-015-2349-8

5. Bilkis R., Lake R.J., Cooper K.L., Tomkinson A., Fan H.Y. The CSB chromatin remodeler regulates PARP1- and PARP2-mediated singlestrand break repair at actively transcribed DNA regions. Nucleic Acids Res. 2023;51(14):7342-7356. https://doi.org/10.1093/nar/gkad515

6. Buffenstein R. The naked mole-rat: a new long-living model for human aging research. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2005;60(11): 1369-1377. https://doi.org/10.1093/gerona/60.11.1369

7. Evdokimov A., Kutuzov M., Petruseva I., Lukjanchikova N., Kashina E., Kolova E., Zemerova T., Romanenko S., Perelman P., Prokopov D., Seluanov A., Gorbunova V., Graphodatsky A., Trifonov V., Khodyreva S., Lavrik O. Naked mole rat cells display more efficient excision repair than mouse cells. Aging (Albany NY). 2018;10(6): 1454-1473. https://doi.org/10.18632/aging.101482

8. Evdokimov A., Popov A., Ryabchikova E., Koval O., Romanenko S., Trifonov V., Petruseva I., Lavrik I., Lavrik O. Uncovering molecular mechanisms of regulated cell death in the naked mole rat. Aging (Albany NY). 2021;13(3):3239-3253. https://doi.org/10.18632/aging.202577

9. Gorbunova V., Seluanov A., Zhang Z., Gladyshev V.N., Vijg J. Comparative genetics of longevity and cancer: insights from long-lived rodents. Nat. Rev. Genet. 2014;15(8):531-540. https://doi.org/10.1038/nrg3728

10. Grube K., Bürkle A. Poly(ADP-ribose) polymerase activity in mononuclear leukocytes of 13 mammalian species correlates with speciesspecific life span. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992;89(24):11759- 11763. https://doi.org/10.1073/pnas.89.24.11759

11. Leung A.K.L. Poly(ADP-ribose): a dynamic trigger for biomolecular condensate formation. Trends Cell Biol. 2020;30(5):370-383. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2020.02.002

12. López-Otín C., Pietrocola F., Roiz-Valle D., Galluzzi L., Kroemer G. Meta-hallmarks of aging and cancer. Cell Metab. 2023;35(1):12-35. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.11.001.5

13. MacRae S.L., Croken M.M., Calder R.B., Aliper A., Milholland B., White R.R., Zhavoronkov A., Gladyshev V.N., Seluanov A., Gorbunova V., Zhang Z.D., Vijg J. DNA repair in species with extreme lifespan differences. Aging (Albany NY). 2015;7(12):1171-1184. https://doi.org/10.18632/aging.100866

14. Rouleau-Turcotte É., Pascal J.M. ADP-ribose contributions to genome stability and PARP enzyme trapping on sites of DNA damage; paradigm shifts for a coming-of-age modification. Biol. Chem. 2023; 299(12):105397. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2023.105397

15. Salmon A.B., Sadighi Akha A.A., Buffenstein R., Miller R.A. Fibroblasts from naked mole-rats are resistant to multiple forms of cell injury, but sensitive to peroxide, ultraviolet light, and endoplasmic reticulum stress. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2008;63(3):232- 241. https://doi.org/10.1093/gerona/63.3.232

16. Schumacher B., Pothof J., Vijg J., Hoeijmakers J.H.J. The central role of DNA damage in the ageing process. Nature. 2021;592(7856): 695-703. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03307-7

17. Singatulina A.S., Hamon L., Sukhanova M.V., Desforges B., Joshi V., Bouhss A., Lavrik O.I., Pastré D. PARP-1 activation directs FUS to DNA damage sites to form PARG-reversible compartments enriched in damaged DNA. Cell Rep. 2019;27(6):1809-1821.e5. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.04.031

18. Sinha S., Molla S., Kundu C.N. PARP1-modulated chromatin remodeling is a new target for cancer treatment. Med. Oncol. 2021;38(10): 118. https://doi.org/10.1007/s12032-021-01570-2

19. Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 inhibits strand-displacement synthesis of DNA catalyzed by DNA polymerase beta. Biochemistry (Moscow). 2004;69(5):558- 568. https://doi.org/10.1023/b:biry.0000029855.68502.fa.