Структурные основы влияния фосфорамидной N-бензимидазольной группы на эффективность удлинения модифицированного праймера

   Недавно нами был предложен новый класс производных нуклеиновых кислот – фосфорамидные бензоазольные олигонуклеотиды. В них один из немостиковых атомов кислорода замещен на фосфорамидную N­бензоазольную группу: бензимидазольную, диметилбензимидазольную, бензоксазольную или бензо­тиазольную. Изучение свойств таких производных показало, что их применение в ПЦР увеличивает специфичность и селективность анализа. Данное исследование посвящено изучению влияния фосфорамидной N-­бензимидазольной модификации ДНК­-праймеров на эффективность их удлинения Taq ДНК­полимеразой при помощи метода молекулярной динамики. Мы рассматривали совершенные комплексы нуклеиновых кислот с модификациями в положениях с первого по шестое считая от 3’­конца праймера. Ранее было показано, что степень подавления элонгации зависит от положения модификации: чем ближе к 3’­концу, тем сильнее ингибирование, а максимальное подавление наблюдается при модификации в первом положении, особенно в несовершенных комплексах. Кроме того, в экспериментах наблюдались продукты неполного удлинения праймеров с модификацией в четвертом положении. Проведенные компьютерное моделирование и анализ позволили выявить молекулярные механизмы взаимодействия модифицированных праймеров с ферментом, включая стерические препятствия для продвижения полимеразы по модифицированной цепи и локальные нарушения структуры ДНК, которые объясняют наблюдаемые экспериментально закономерности. Установлено, что как различные стереоизомеры фосфорамидных групп, так и конформеры фосфорамидной N­-бензимидазольной группы по­-разному влияют на структуру фермент­субстратного комплекса и эффективность взаимодействия Taq ДНК-­полимеразы с модифицированным ДНК- комплексом. Модификация первого и второго межнуклеозидного фосфатного остатка с 3’­конца праймера в наибольшей степени возмущает структуру белково­нуклеинового комплекса, а при расположении модификации в четвертом фосфатном остатке N­бензимидазольная модифи­кация располагается в кармане фермента. Полученные результаты открывают перспективы для рационального конструирования специфичных, обладающими заранее заданными свойствами ДНК-праймеров с модифицированными N­бензимидазольными межнуклеотидными звеньями для использования в ПЦР-диагностике.

1. Abramson J., Adler J., Dunger J., Evans R., Green T., Pritzel A., Ronneberger O., … Bapst V., Kohli P., Jaderberg M., Hassabis D., Jumper J.M. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 2024;630(8016):493-500. doi: 10.1038/s41586-024-07487-w

2. Case D.A., Belfon K., Ben-Shalom I.Y., Brozell S.R., Cerutti D.S., Cheatham T.E. III, Cruzeiro V.W.D., … Wu X., Xiong Y., Xue Y., York D.M., Kollman P.A. Amber 20. San Francisco, Univ. of California, 2020. Available at: https://ambermd.org/doc12/Amber20.pdf

3. Chubarov A.S., Oscorbin I.P., Filipenko M.L., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V. Allele-specific PCR for KRAS mutation detection using phosphoryl guanidine modified primers. Diagnostics. 2020;10(11): 872. doi: 10.3390/diagnostics10110872

4. Chubarov A.S., Oscorbin I.P., Novikova L.M., Filipenko M.L., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V. Allele-specific PCR for PIK3CA mutation detection using phosphoryl guanidine modified pri mers. Diagnostics. 2023;13(2):250. doi: 10.3390/diagnostics13020250/S1

5. Chubarov A.S., Baranovskaya E.E., Oscorbin I.P., Yushin I.I., Filipenko M.L., Pyshnyi D.V., Vasilyeva S.V., Lomzov A.A. Phosphoramidate azole oligonucleotides for single nucleotide polymorphism detection by PCR. Int J Mol Sci. 2024;25(1):617. doi: 10.3390/ijms25010617

6. Di Giusto D., King G.C. Single base extension (SBE) with proofreading polymerases and phosphorothioate primers: improved fidelity in single-substrate assays. Nucleic Acids Res. 2003;31(3):e7. doi: 10.1093/nar/gng007

7. Eom S.H., Wang J., Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site. Nature. 1996;382(6588):278-281. doi: 10.1038/382278A0

8. Golyshev V.M., Yushin I.I., Gulyaeva O.A., Baranovskaya E.E., Lomzov A.A. Properties of phosphoramide benzoazole oligonucleotides (PABAOs). I. Structure and hybridization efficiency of N-benzimidazole derivatives. Biochem Biophys Res Commun. 2024;693: 149390. doi: 10.1016/j.bbrc.2023.149390

9. Golyshev V.M., Morozova F.V., Berdugin A.A., Kozyreva E.A., Baranovskaya E.E., Yushin I.I., Lomzov A.A. Structural and thermodynamic insights for enhanced SNP detection using N-benzimida zole oligonucleotides. J Phys Chem B. 2025;129(44):11409-11420. doi: 10.1021/acs.jpcb.5c04047

10. Ishige T., Itoga S., Matsushita K. Locked nucleic acid technology for highly sensitive detection of somatic mutations in cancer. Adv Clin Chem. 2018;83:53-72. doi: 10.1016/bs.acc.2017.10.002

11. Izadi S., Anandakrishnan R., Onufriev A.V. Building water models: a different approach. J Phys Chem Lett. 2014;5(21):3863-3871. doi: 10.1021/jz501780a

12. Kalendar R., Baidyussen A., Serikbay D., Zotova L., Khassanova G., Kuzbakova M., Jatayev S., Hu Y.G., Schramm C., Anderson P.A., Jenkins C.L.D., Soole K.L., Shavrukov Y. Modified “Allele-specific qPCR” method for SNP genotyping based on FRET. Front Plant Sci. 2022;12:747886. doi: 10.3389/fpls.2021.747886

13. Kutyavin I.V. Use of base modifications in primers and amplicons to improve nucleic acids detection in the real-time snake polymerase chain reaction. Assay Drug Dev Technol. 2011;9(1):58-68. doi: 10.1089/adt.2010.0303

14. Li Y., Korolev S., Waksman G. Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation. EMBO J. 1998;17(24):7514-7525. doi: 10.1093/emboj/17.24.7514

15. Li Z., Song L.F., Li P., Merz K.M. Systematic parametrization of divalent metal ions for the OPC3, OPC, TIP3P-FB, and TIP4P-FB water models. J Chem Theory Comput. 2020;16(7):4429-4442. doi: 10.1021/acs.jctc.0c00194

16. Meagher K.L., Redman L.T., Carlson H.A. Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field. J Comput Chem. 2003;24(9):1016-1025. doi: 10.1002/jcc.10262

17. Nonin S., Leroy J.L., Guéron M. Terminal base pairs of oligodeoxynucleotides: imino proton exchange and fraying. Biochemistry. 1995; 34(33):10652-10659. doi: 10.1021/bi00033a041

18. Novgorodtseva A.I., Vorob’ev A.Y., Lomzov A.A., Vasilyeva S.V. Synthesis and physicochemical properties of new phosphoramide oligodeoxyribonucleotides. I. N-caffeine derivatives. Bioorg Chem. 2025; 157:108313. doi: 10.1016/j.bioorg.2025.108313

19. Pettersen E.F., Goddard T.D., Huang C.C., Couch G.S., Greenblatt D.M., Meng E.C., Ferrin T.E. UCSF Chimera – a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 2004;25(13):1605-1612. doi: 10.1002/jcc.20084

20. Rejali N.A., Moric E., Wittwer C.T. The effect of single mismatches on primer extension. Clin Chem. 2018;64(5):801-809. doi: 10.1373/clinchem.2017.282285

21. Roe D.R., Cheatham T.E. PTRAJ and CPPTRAJ: software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. J Chem Theory Comput. 2013;9(7):3084-3095. doi: 10.1021/ct400341p

22. Shapovalov M.V., Dunbrack R.L. A smoothed backbone-dependent rotamer library for proteins derived from adaptive kernel density estimates and regressions. Structure. 2011;19(6):844-858. doi: 10.1016/j.str.2011.03.019

23. Starza I.D., Eckert C., Drandi D., Cazzaniga G.; EuroMRD Consortium. Minimal residual disease analysis by monitoring immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements by quantitative PCR and droplet digital PCR. Methods Mol Biol. 2022;2453:79-89. doi: 10.1007/978-1-0716-2115-8_5

24. Strahs D., Schlick T. A-tract bending: insights into experimental structures by computational models. J Mol Biol. 2000;301(3):643-663. doi: 10.1006/jmbi.2000.3863

25. Terpe K. Overview of thermostable DNA polymerases for classical PCR applications: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 2013;97(24):10243-10254. doi: 10.1007/s00253-013-5290-2

26. Tian C., Kasavajhala K., Belfon K.A.A., Raguette L., Huang H., Migues A.N., Bickel J., Wang Y., Pincay J., Wu Q., Simmerling C. ff19SB: amino-acid-specific protein backbone parameters trained against quantum mechanics energy surfaces in solution. J Chem Theory Comput. 2020;16(1):528-552. doi: 10.1021/acs.jctc.9b00591

27. Unni S., Huang Y., Hanson R.M., Tobias M., Krishnan S., Li W.W., Nielsen J.E., Baker N.A. Web servers and services for electrostatics calculations with APBS and PDB2PQR. J Comput Chem. 2011; 32(7):1488-1491. doi: 10.1002/jcc.21720

28. Vasilyeva S.V., Baranovskaya E.E., Dyudeeva E.S., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V. Synthesis of oligonucleotides carrying inter-nucleotide N-(benzoazole)-phosphoramide moieties. ACS Omega. 2023; 8(1):1556-1566. doi: 10.1021/acsomega.2c07083

29. Vinogradova O.A., Pyshnyi D.V. Selectivity of enzymatic conversion of oligonucleotide probes during nucleotide polymorphism analysis of DNA. Acta Naturae. 2010;2(1):40-58. doi: 10.32607/20758251-2010-2-1-36-52

30. Yushin I.I., Golyshev V.M., Novgorodtseva A.I., Lomzov A.A. Properties of phosphoramide benzoazole oligonucleotides (PABAOs). II. Structure and hybridization efficiency of N-benzoxazole derivatives. Biochem Biophys Res Commun. 2024;740:150997. doi: 10.1016/j.bbrc.2024.150997

31. Zgarbová M., Otyepka M., Šponer J., Lankaš F., Jurečka P. Base pair fraying in molecular dynamics simulations of DNA and RNA. J Chem Theory Comput. 2014;10(8):3177-3189. doi: 10.1021/ct500120v

32. Zgarbová M., Šponer J., Jurečka P. Z-DNA as a touchstone for additive empirical force fields and a refinement of the Alpha/Gamma DNA torsions for AMBER. J Chem Theory Comput. 2021;17(10):6292-6301. doi 10.1021/acs.jctc.1C00697